结直肠癌是世界上最常见的癌症之一，全世界每年的新发结直肠癌病例占所有新发癌症病例的10%。虽然在病理学和遗传学方面研究表明结肠腺瘤先发于大多数腺癌，但我们对结直肠癌发生和不良预后的分子机制了解甚少。Parafibromin是由HRPT2基因编码的肿瘤抑制因子，在甲状旁腺癌、乳腺癌、胃癌及结直肠癌中，均发现parafibromin表达下调，并与肿瘤恶性病理生物学行为关系密切。Parafibromin蛋白可与剪切多聚腺苷酸特异性因子(cleavage and polyadenylation specificity factor，CPSF)、剪切刺激因子(leavage stimulation factor，CStF)及偶对蛋白(symplekin)形成复合物，还可以与组蛋白甲基转移酶(HMT)和多聚腺苷化元件结合蛋白1(CPEB1)相互作用，这些复合体可结合于核酸序列后调节启动子活性或mRNA成熟，进而参与细胞周期、细胞增殖、凋亡、分化、迁徙和转移等生物学活动。第一部分结直肠癌组织中parafibromin的表达及其临床病理意义目的:研究parafibromin在结直肠癌组织中的定位和表达及其与临床病理特征的相关性,以初步探讨parafibromin在结直肠癌中表达的临床病理意义。方法:1.采用RT-PCR方法检测15例冰冻结直肠癌及癌旁组织中的parafibromin mRNA的表达；2.采用Western蛋白印迹方法检测15例冰冻结直肠癌及癌旁组织中的parafibromin蛋白的表达；3.构建组织芯片，利用免疫组织化学SP方法检测结直肠癌（n=306）及癌旁组织（n=279）中parafibromin蛋白表达,分析结直肠癌组织中parafibromin蛋白表达的临床病理意义。4.所有数据用SPSS13.0软件进行统计分析，Spearman秩相关系数检验分析parafibromin表达与临床病理资料关系。Kaplan-Meier法建立生存曲线，Cox比例风险回归分析建立多因素生存分析数据的比例危险模型。P<0.05视为具有统计学差异。结果:1.结直肠癌冰冻组织标本中的parafibromin mRNA及蛋白的表达15例结直肠癌及癌旁组织样本中，各有4例mRNA未出现目的条带，parafibromin mRNA表达的阳性率各为73.3%（11/15）。统计分析显示，结直肠癌组织中的parafibromin mRNA表达水平与癌旁组织无明显差异（P>0.05）。15例癌旁组织样本中，有2例蛋白样品未出现目的条带；15例结直肠癌组织样本均有parafibromin表达，结直肠癌组织中的parafibromin蛋白表达水平与癌旁组织无明显差异（P>0.05）。2.结直肠癌组织中parafibromin蛋白表达与临床病理参数的关系。应用免疫组化方法检测parafibromin蛋白在结直肠癌及癌旁组织中的表达情况，结果显示parafibromin蛋白表达于细胞核。Parafibromin蛋白在癌和癌旁组织中阳性表达率分别为53.9%（165/306）和91.4%（255/279）。统计学分析显示，在结直肠癌组织中parafibromin蛋白表达低于癌旁正常粘膜（P﹤0.05）。Parafibromin蛋白表达与患者性别（P=0.292）、年龄（P=0.758）及静脉侵袭（P=0.173）因素无关，parafibromin蛋白表达与肿瘤直径（P=0.019）、UICC分期（P=0.017）及淋巴结转移（P=0.009）呈负相关。Kaplan-Meier法建立生存曲线，显示parafibromin蛋白表达阳性患者累积生存率明显高于阴性患者（P﹤0.05）。COX比例风险回归分析表明parafibromin蛋白表达是结直肠癌患者独立的预后因素（P>0.05）。结论:1.结直肠癌组织中parafibromin mRNA和蛋白表达水平与癌旁正常黏膜组织无明显差异。2.临床病理分析结果显示parafibromin在结直肠癌中的表达降低可能参与结直肠癌的生长和转移。3. Parafibromin表达降低可能影响结直肠癌患者的生存时间，可以作为评估预后的有效生物学标志物。第二部分parafibromin重组载体转染细胞的生物学效应及其机制研究目的:研究外源基因parafibromin对结肠癌细胞株DLD-1的影响及其可能机理。方法:1.选取结肠癌细胞株DLD-1稳定转染parafibromin真核表达质粒，通过western和RT-PCR检测单克隆中parafibromin的转录和翻译水平，挑选出稳定高表达parafibromin蛋白的单克隆细胞株；2.采用PI染色检测转染前后细胞周期改变，ALP活性检测转染前后细胞分化情况，划痕修复实验及Transwell实验检测转染前后细胞侵袭和转移水平，通过这一系列的实验来研究转染后细胞的生物行为学改变；3.采用qRT-PCR方法检测周期和凋亡因子的mRNA表达水平。结果:1.稳定转染parafibromin真核表达质粒后，检测单克隆细胞株parafibromin mRNA和蛋白表达我们选取结肠癌细胞株DLD-1稳定转染parafibromin的真核表达重组载体，挑选出3种单克隆细胞株检测mRNA和蛋白的表达，发现仅有1号克隆的mRNA和蛋白表达水平明显高于未转染细胞株，达到未转染细胞株的两倍以上，差异有统计学意义（P﹤0.05），而其它单克隆细胞株未见明显改变（P>0.05）。2. Parafibromin转染前后，DLD-1的生物行为学改变Parafibromin转染后，细胞各周期所占比例为G1（53.5%）,S(30.5%)和G2(16.0%)；未转染细胞各周期所占比例为G1（48.5%）,S(26.5%)和G2(25.0%),转染后G1和S期所占细胞比例明显升高，而G2期所占细胞比例显著下降，差异有统计学意义（P﹤0.05）；Parafibromin转染后，细胞的ALP活性为12pg/ug，未转染细胞的ALP活性为6.5pg/ug,转染后细胞的碱性磷酸酶活性显著升高，差异有统计学意义（P﹤0.05）；parafibromin转染后的细胞，Transwell试验中未见侵袭，未转染细胞也未见侵袭，两者未见明显差异（P>0.05）；细胞划痕实验中，parafibromin转染细胞12h迁移68.9um，24h迁移118.9um，未转染细胞12h迁移58.9um，24h迁移124.6um，两者未见明显差异（P>0.05）。3. Parafibromin转染前后，周期和凋亡因子mRNA的表达水平Parafibromin转染细胞中，c-myc、cyclinD1、cdc2、AKT1、AKT2及Bad mRNA表达降低，parafibromin、cyclinB1mRNA表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。转染后，p21、p27、cyclinE1、AKT3、Bax、β-catenin mRNA未见明显差异（P>0.05）。结论:1. DLD-1细胞稳定转染parafibromin重组载体后，parafibromin mRNA和蛋白表达升高。2.转染parafibromin后，DLD-1出现细胞周期阻滞，parafibromin促进DLD-1细胞分化，但不抑制细胞侵袭和转移。3.转染parafibromin后，细胞周期蛋白mRNA表达降低，抑制凋亡因子mRNA表达下降。