论文部分内容阅读
1、研究背景和目的内毒素血症是一种由内毒素(主要成分为脂多糖,LPS)进入血液引起的急性病症。LPS在血液中会激活巨噬细胞、树突状细胞等,使其大量释放促炎细胞因子,导致补体系统和凝血系统异常活化,引起多器官的微血管循环障碍、弥漫性血管内凝血、休克甚至死亡。白介素-10(interleukin-10,IL-10)是一种重要的免疫调节因子,在内毒素血症中能抑制巨噬细胞等的活化和促炎细胞因子的产生,抑制过激的免疫反应,减少炎症损伤。IL-10可以在内毒素血症的临床试验中降低促炎细胞因子水平,在内毒素血症小鼠中也能抑制炎症反应,提高生存率。中药两面针是芸香科植物两面针(Zanthoxylum nitidum)的干燥根,用于跌打损伤、牙龈炎、风湿病等的治疗。氯化两面针碱(nitidine chloride,NC)是两面针的主要活性成分。课题组前期研究发现NC能促进LPS刺激下树突状细胞中IL-10的表达。本研究旨在确定NC调控IL-10的作用特征,考察其作用靶点和作用机制,并在小鼠内毒素血症模型中考察其体内抗炎活性。2、研究方法(1)NC调控IL-10表达的作用特征研究本研究使用了RAW264.7巨噬细胞系、THP-1单核细胞系和原代细胞骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)、腹腔巨噬细胞。在采用CCK8实验、乳酸脱氢酶实验和Annexin V-PI染色测定NC的细胞毒性后,我们在无毒性剂量范围内考察了NC调控上述免疫细胞表达IL-10的时间特征和浓度依赖性。IL-10 mRNA水平采用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)测定,IL-10蛋白分泌量采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定。(2)NC通过抑制TOP1调控IL-10的靶标研究首先,我们用拓扑异构酶1(topoisomeraseⅠ,TOP1)和超螺旋DNA测定了NC对TOP1酶活性的抑制作用。其次,我们测定了TOP1抑制剂拓扑替康(Topotecan,TPT)和伊立替康(irinotecan,CPT-11)的活性代谢物SN-38的细胞毒性及对IL-10表达量的影响。接着,我们以含TOP1干扰shRNA的慢病毒转染THP-1细胞,以蛋白免疫印迹和qPCR测定了其对TOP1基因的敲减效果。最后,我们考察了TOP1敲减对NC、SN-38、TPT调控IL-10表达的影响。(3)考察NC和TOP1抑制剂在小鼠内毒素血症模型中的作用首先,我们以LPS腹腔注射Balb/c雄性小鼠构建内毒素血症模型,考察无毒剂量下的NC、CPT-11和TPT对小鼠生存率的影响。其次,使用ELISA测定了小鼠血清中IL-10和促炎细胞因子TNF-α、IL-6的浓度,使用qPCR测定了IL-10、TNF-α和IL-6在肝和肺组织中的表达水平。接着,我们使用了IL-10敲除小鼠和Anti-IL-10抗体来研究IL-10的作用。在这两种条件下测定了NC和TOP1抑制剂对小鼠生存率和血清促炎细胞因子的影响。最后,在IL-10缺陷的腹腔巨噬细胞和Anti-IL-10抗体封闭的RAW264.7细胞中,考察了NC和TOP1抑制剂对促炎细胞因子的调控。(4)NC和TOP1抑制剂促进IL-10表达的作用机制研究首先,采用mRNA降解实验考察NC和TOP1抑制剂对IL-10 mRNA稳定性的影响。其次,采用蛋白免疫印迹实验测定了NC和TOP1抑制剂对PI3K-Akt通路的活化,并使用通路抑制剂考察该通路在NC和TOP1抑制剂调控IL-10表达中发挥的作用。接着,我们使用洗脱实验考察了NC和TOP1抑制剂调控IL-10表达的可逆性,使用彗星实验和H2AX,ATM,ATR和Akt磷酸化水平来测定药物引起的DNA损伤应答。最后,我们运用ATM和ATR抑制剂阻断DNA损伤应答,测定这对于NC和TOP1抑制剂调控IL-10表达的影响。3、研究结果(1)NC在无毒剂量范围内(1~4μM)能浓度依赖地增强RAW264.7巨噬细胞、THP-1单核细胞、BMDCs和腹腔巨噬细胞在LPS刺激下IL-10的表达,这些细胞均是髓系免疫细胞。NC在无LPS刺激时无法单独促进IL-10的表达,NC预作用时间低于9 h时也无法增强IL-10的表达。(2)在体外酶活实验中,NC能抑制TOP1酶的活性。在髓系免疫细胞中,无细胞毒剂量的TOP1抑制剂SN-38(25-100 nM)和TPT(50-200 nM)也能显著提高LPS刺激下的IL-10 mRNA水平和IL-10蛋白分泌量,与NC的效果类似。以shRNA敲减TOP1基因会增强IL-10的表达,且会阻断NC、SN-38、TPT对IL-10表达的上调。(3)在小鼠内毒素血症模型中,无毒剂量的NC(5 mg/kg)和TOP1抑制剂CPT-11(10 mg/kg),TPT(0.5 mg/kg)能显著提高小鼠的生存率至70~80%。内毒素血症模型小鼠和空白对照小鼠相比,血清和肝、肺组织中促炎细胞因子产生量激增,IL-10表达量也有所增多;给予NC和TOP1抑制剂可进一步促进IL-10的产生,抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-6的产生。在IL-10敲除小鼠和AntiIL-10抗体处理的普通小鼠的内毒素血症模型中,NC和CPT-11无法显著提高小鼠生存率,且对促炎细胞因子TNF-α和IL-6的抑制作用显著减弱,在IL-10敲除小鼠的腹腔巨噬细胞和Anti-IL-10抗体处理的RAW264.7细胞中,NC和SN-38对促炎细胞因子的抑制作用也显著减弱。这意味着IL-10参与了药物作用下促炎细胞因子的下调,且介导了药物的治疗作用。(4)在LPS刺激的RAW264.7细胞中,NC和TOP1抑制剂显著提高了IL-10 mRNA水平,但并不影响IL-10 mRNA的降解。使用通路抑制剂考察LPS刺激下调控IL-10表达的多条通路发现,PI3K/Akt通路在NC上调IL-10表达中发挥着关键作用。NC和TOP1抑制剂均可浓度依赖地促进Akt的活化和其下游GSK3β、CREB的磷酸化从而促进IL-10表达,PI3K和Akt抑制剂可阻断药物对IL-10的上调。在内毒素血症小鼠模型中,NC也通过活化Akt来促进IL-10表达和发挥治疗作用。NC和TOP1抑制剂可在无细胞毒浓度下引起DNA损伤,增强H2AX磷酸化,激活DNA损伤应答,从而促进ATM、ATR和Akt的活化。在LPS刺激的条件下,H2AX磷酸化减弱,ATM、ATR和Akt的磷酸化加强,从而增强IL-10的表达。使用ATM和ATR抑制剂阻断DNA损伤应答会阻止NC和TOP1抑制剂促进IL-10表达,且会增加药物的细胞毒性。4、结论与意义天然产物NC可通过抑制TOP1而促进髓系免疫细胞在LPS刺激下表达IL-10。临床使用的TOP1抑制剂SN-38、TPT也能发挥类似的效果。NC和TOP1抑制剂在小鼠内毒素血症模型中能通过促进IL-10表达来抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-6的产生,减少肝、肺炎症损伤,提高小鼠生存率。NC和TOP1抑制剂能够在无细胞毒性的较低剂量下,引起可修复的DNA损伤,激活DNA损伤应答中关键激酶ATM和ATR,进而促进Akt的活化,从而增强LPS刺激下IL-10的转录和表达。本研究考察了NC调控IL-10表达的靶点和在内毒素血症中的抗炎活性,发现了TOP1抑制剂能在无毒剂量下发挥的体内抗炎活性,这为内毒素血症的防治提供了新的候选药物。此外,在研究NC和TOP1抑制剂调控IL-10的作用机制的过程中,本研究将DNA损伤应答与炎症反应联系了起来,指出可修复的DNA损伤可能带来抗炎的有利作用。