论文部分内容阅读
目的近年来,随着经济的发展,人们生活水平的提高和饮食结构的改变,食物中毒事件时有发生,并且发病规模逐年扩大,在微生物性食物中毒事件中由副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,V.parahaemolyticus)引起的占到首位。随着临床治疗及水产养殖过程中抗菌药物的大量使用,副溶血性弧菌的耐药性逐渐增强,甚至出现多重耐药性。因此,很多研究者对副溶血性弧菌的耐药状况及基因分型进行了研究,但目前国内外尚缺乏对我国黄海周边地区副溶血性弧菌的耐药状况及基因分型的研究报道。本文以该地区的21株临床分离株、19株环境分离株为研究对象,通过药敏试验和分子生物学技术,研究40株不同来源的副溶血性弧菌的耐药性和基因分型,为遗传进化、临床诊断、医院感染监控以及合理使用抗菌药物提供理论依据和技术支持。方法1.从我国黄海附近水域的多个地点的泥沙、沉积物、淤泥及附近某医院腹泻患者的粪便中采集标本,将疑是副溶血性弧菌的42株菌株进行分离培养,采用VITEK-2Compact全自动微生物生化鉴定系统对培养物进行鉴定,将鉴定结果为副溶血性弧菌的菌株进行保存。2.从-80℃冰箱中取出2015-2016年收集的40株副溶血性弧菌,接种到TCBS培养基上进行复苏,并置于37℃恒温培养12h,采用VITEK-2 Compact全自动微生物药敏分析系统对不同来源的副溶血性弧菌进行药敏实验,通过药敏差异分析,及时掌握副溶血性弧菌的耐药状况。3.采用PCR手段,以副溶血性弧菌的基因组为模板,根据国际多位点序列分型数据库(http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)上已发表的7对特异性引物序列(recA、gyrB、dnaE、dtdS、pntA、pyrC和tnaA),进行扩增反应、测序和序列分析。采用多位点序列分型(multilocus sequencing typing,MLST)技术对不同来源的副溶血性弧菌进行基因分型。4.采用MEGA6.06软件中的Neighbor-joining法构建系统进化树,比较不同来源菌株间遗传的差异性和相关性,推断流行株的播散途径。结果1.经VITEK-2 Compact全自动微生物生化鉴定系统分析,其中40株菌株为副溶血性弧菌,2株环境株为美人鱼弧菌(剔除)。副溶血性弧菌在TCBS培养基平板上生长状况良好,呈现出绿色、圆形、半透明状、表面光滑的菌落,用接种环轻触,有粘稠感,直径为2mm~3mm。2.40株不同来源的副溶血性弧菌存在1种耐药谱,对氨苄西林耐药(40株,耐药率100%),对头孢唑啉中介(15株,中介率为37.5%),对头孢他啶、亚胺培南和左氧氟沙星等其余15种抗菌药物均敏感,没有检测出多重耐药菌株。3.通过多位点序列分型,40株不同来源的副溶血性弧菌共有22个序列型(sequence type,ST),优势序列型为ST3,占25%(10/40),其他主要序列型有ST332,占20%(8/40);ST1533,占5%(2/40);ST1545,占5%(2/40)。其中17株为首次发现的ST型,新的ST型号分别为ST1533、ST1534、ST1535、ST1536、ST1537、ST1538、ST1539、ST1540、ST1541、ST1542、ST1543、ST1545、ST1546、ST1547、ST1548、ST1549和ST1550。其中10株副溶血性弧菌临床分离株有克隆复合体,为CC3。4.在系统进化树中,40株不同来源的副溶血性弧菌被分为2个群,临床株VP11为一个群,其他39株属于另外一个群。其中,环境株VP28和临床株VP17为不同序列型,却在进化树上表现出100%的遗传关系;VP22和VP24,VP23和VP26在进化树上也表现出高度的亲缘性(100%)。结论1.40株不同来源的副溶血性弧菌的耐药结果基本一致:均对氨苄西林耐药,部分对头孢唑啉中度敏感,对头孢他啶、亚胺培南和左氧氟沙星等抗菌药完全敏感,未出现多重耐药菌株。这说明目前临床上大部分抗菌药物的使用都是可行的。建议医生对感染副溶血性弧菌的食物中毒者和水生动物,不要经验使用青霉素类氨苄西林及第一代头孢菌素头孢唑啉等,可以使用二、三代头孢菌素(头孢克洛、头孢他啶等),β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物(氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦等)和喹诺酮类抗菌药物(环丙沙星、诺氟沙星)等进行治疗。2.40株不同来源的副溶血性弧菌有22个ST型,说明我国黄海附近地区的副溶血性弧菌存在遗传多态性。其中17个ST型为第一次发现的,同时扩充了副溶血性弧菌的国际多位点序列分型数据库(http://pubmlst.org/vparahaemol yticus/)。在新发现的17个ST型中,其中15个是环境株,说明我国黄海附近海域的副溶血性弧菌的研究存在不足。3.40株不同来源的副溶血性弧菌多位点序列分型结果表现多样化,这可能是由于recA位点发生了突变。recA基因的高突变增加了副溶血性弧菌的遗传多态性。4.由进化树可知,40株菌株被分成两大群,临床分离株VP11为一群,其他为一群。环境分离株VP28和临床分离株VP17的亲缘关系为100%,证实了致病菌株在临床和环境之间的散播。