在我国,慢性肾脏病(Chronic kidney disease, CKD)的发病率逐年升高。CKD主要表现为尿蛋白排泄增加,肾功能进行性减退,最终发展为终末期肾衰竭,足细胞在此过程中起着重要作用。足细胞(Podocyte)在胚胎发育时起源于间充质细胞,发育成熟后是肾小球滤过屏障的重要组成部分,足细胞和神经细胞形态类似,且都是终末分化细胞,增殖能力非常有限。足细胞通过α3β1整合素粘附在基底膜而保持其结构和功能完整性,当足细胞发生表型改变,α3β1整合素减少时,足细胞粘附力下降引发足细胞脱落。足细胞不可逆的损伤和丢失是导致大量蛋白尿和肾小球硬化的重要病理基础。但目前尚没有对针对足细胞损伤和丢失切实有效的治疗方法。近年来我们课题组在线粒体功能障碍(Mitochondria dysfunction, MtD)与足细胞损伤中的作用开展了大量的前期研究,发现MtD是足细胞损伤的早期事件,可直接介导足细胞损伤。由此,我们推测,线粒体功能可能是慢性肾脏病足细胞损伤和丢失的干预靶点。PGC-1家族(Peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1 family)包括PGC-1α, PGC-1β和PRC (PGC-1 related coactivator)三个成员,其在能量代谢和线粒体合成中起着重要作用。PGC-1α为转录共激活因子,主要表达于能量需求高或富含线粒体的组织中,如心脏、肾、骨骼肌等。其具有多种重要的生理学功能,如调节线粒体生物合成、葡萄糖代谢、肌纤维类型的转化、脂肪酸氧化等。PGC-1α通过以下两个方面调控整个细胞代谢和线粒体功能：1、增加线粒体生物合成引起细胞重构,2、改变线粒体功能重构细胞器。PGC-1α一方面增加氧化代谢,线粒体产生大量的活性氧(Reactive oxygen species, ROS),一方面增强抗氧化酶表达,如过氧化物还原酶3 (Peroxiredoxin 3, PRX3)、过氧化氢酶还原酶5(Peroxiredoxin 5, PRX5)、MnSOD、线粒体型硫氧还蛋白还原酶以及过氧化氢酶等,迅速降低胞内ROS水平。PGC-1α可以与核呼吸因子(Nuclearrespiratory factor,NRF)相互作用,促进线粒体转录因子A(Mitochondrial transcription factor A,TFAM)表达,促进线粒体DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA)的转录、复制和修复。mtDNA和核基因组共同编码氧化磷酸化途径相关的呼吸链酶,PGC-1α通过与NRF的作用促进三磷酸腺苷(Adenosine-5’-triphosphate, ATP)产生增加。课题组前期研究发现在体外培养的足细胞中,PGC-1α可以通过阻断线粒体功能障碍减少足细胞损伤,但PGC-1α在体内足细胞中的作用尚不清楚,本研究通过肾小球足细胞条件性PGC-1α基因敲除及转基因小鼠,阐明PGC-1α在体内足细胞损伤中的作用及其机制。第一部分PGC-la在慢性肾脏病患儿肾活检组织中的表达目的：观察PGC-1α、WT-1、a3-integrin在慢性肾脏病患儿(FSGS.MCD)肾组织中的表达水平。分析PGC-1α与足细胞表型改变、足细胞数目减少是否具有相关性。方法：慢性肾脏病患儿共20例,男12例,女8例,平均年龄5岁9个月。局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)和微小病变(MCD)各10例。正常对照组肾脏组织来源于肾脏肿瘤切除术后肿瘤周边肾组织,共6例。应用免疫组化检测活检肾组织中PGC-1α的表达,免疫荧光观察WT-1和a3-integrin表达。分析PGC-1α与WT-1和a3-integrin表达的相关性。结果：对照组免疫组化染色结果显示肾脏组织都可见PGC-1α表达,但在小管中近段肾小管表达最多,远端小管、集合管表达相对较少,在肾小球中足细胞和系膜细胞表达较多,CKD患儿的活检肾组织PGC-1α表达量较对照组明显减少,FSGS组较对照组减少近90%,MCD组减少50%。WT-1和a3-integrin在CKD患儿活检肾组织中也明显减少,FSGS患儿减少比MCD患儿减少更显著。半定量分析显示PGC-la减少与a3-integrin、WT-1减少呈正相关。结论：PGC-1α在FSGS及MCD患儿中表达减少,且FSGS减少较MCD减少更为显著。PGC-1α在慢性肾脏病中减少与a3-integrin、WT-1减少有正相关性。第二部分足细胞条件性PGC-1α基因敲除加重醛固酮诱导的线粒体功能障碍和足细胞损伤目的：揭示足细胞条件性PGC-1α基因敲除对醛固酮诱导的线粒体功能障碍和足细胞损伤的影响。方法：体外培养小鼠足细胞系MPC5,应用不同浓度的醛固酮(0,50,100,200nmol/L)或100 nmol/L醛固酮刺激不同时间点(0,2,4,8,12,24h)。构建足细胞条件性PGC-1α基因敲除小鼠,进行基因型鉴定,纯合雄性PGC-1αflox/flox NPHS2cre(+)即为足细胞条件性PGC-1α基因敲除小鼠(CKO),纯合雄性PGC-1α flox/flox为野生对照组(WT),通过腹腔埋置醛固酮微量渗透泵构建慢性醛固酮肾损伤小鼠模型,收集0、7、14天24小时尿液,于第14天后处死小鼠,留取血清及肾组织。采用Western blotting和qRT-PCR检测α3-integrin、PGC-1α、足细胞标志性蛋白Nephrin以及成纤维细胞标志蛋白MMP9、α-SMA和desmin的表达；细胞粘附检测试剂盒测定足细胞粘附功能。试剂盒检测尿白蛋白、肌酐、BUN,提取组织/细胞DNA,qRT-PCR检测线粒体DNA拷贝数。荧光素酶法检测ATP含量,分离肾小球、试剂盒检测线粒体呼吸链活性(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),PAS染色光镜下观察肾组织形态学改变,电镜下观察足突改变。结果：(1)醛固酮呈剂量及时间依赖性地降低足细胞PGC-1α表达,并诱导足细胞表型改变,上调MMP9,α-SMA和desmin而抑制P-cadherin和nephrin的表达。醛固酮亦呈剂量及时间依赖性地抑制足细胞表面粘附分子α3-integrin的表达,并降低足细胞粘附能力。50μmol/L化乙锭(EtBr)诱导足细胞线粒体功能障碍：表现为线粒体DNA拷贝数、线粒体膜电位下降及活性氧产生增加,线粒体功能障碍进一步上调MMP9,α-SMA和desmin并抑制P-cadherin和nephrin的表达。(2)醛固酮(300ng/kg/d)灌注14天后,WT小鼠24小时尿白蛋白定量达100gg/24h(约正常值4.5倍),CKO小鼠尿蛋白是WT小鼠的1.8倍；电镜观察WT小鼠足突发生融合,而CKD小鼠足突融合更广泛,PAS染色显示在WT小鼠中肾小球肿大,系膜细胞及基质增生,而CKO小鼠肾小球明显肿大,系膜细胞及基质增生更明显；a3-integrin在WT小鼠减少50%,而CKO小鼠中减少达90%,desmin在WT小鼠中升高约2倍,CKO小鼠中升高约4倍,nephrin在WT小鼠下降约50%,在CKO小鼠减少约70%；WT-1免疫荧光后统计分析显示在WT小鼠数目减少20%,而在CKO小鼠中减少达45%。分离肾小球,检测线粒体功能指标发现醛固酮灌注后WT小鼠mtDNA拷贝数和ATP合成降低约50%,在CKO小鼠达70%,线粒体呼吸链酶活性Ⅰ和Ⅳ在WT小鼠中明显减少(70%,45%),CKO小鼠加重了活性链酶活性损伤(90%,70%)。结论：醛固酮抑制足细胞PGC-1α的表达并促进表型改变,线粒体功能障碍介导足细胞表型变化；足细胞条件性PGC-1α基因敲除加重醛固酮诱导的线粒体功能障碍和足细胞损伤,提示PGC-1α在维持足细胞正常功能中发挥重要作用。第三部分过表达PGC-1α通过保护线粒体功能阻断醛固酮诱导的足细胞损伤目的：明确PGC-1α过表达能否通过保护线粒体功能阻断醛固酮诱导的足细胞损伤。方法：体外培养小鼠足细胞系MPC5,瞬时转染Ad-PGC-1α腺病毒载体过表达PGC-1α后再给予醛固酮(200 nmol/L)刺激。构建全身过表达PGC-1α转基因小鼠,腹腔埋置微量泵构建醛固酮慢性灌注肾损伤小鼠模型,于第14天处死小鼠,留取血清、尿及肾组织标本。Western blotting和qRT-PCR检测nephrin、 PGC-1α、α3-integrin的表达以及成纤维细胞标志蛋白MMP9、α-SMA和desmin的表达,Western blotting和qRT-PCR检测全身各组组中PGC-1α的表达,荧光素酶法检测细胞内ATP含量,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位,试剂盒提取组织／细胞DNA,RT-PCR检测线粒体DNA拷贝数；试剂盒检测24h尿白蛋白定量和肌酐、尿素氮,分离肾小球试剂盒检测线粒体呼吸链活性(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),PAS染色光镜下观察肾组织形态学改变,电镜下观察足突改变。结果：(1)转染Ad-PGC-1α腺病毒后,PGC-1α表达升高了2倍,过表达PGC-1α阻断醛固酮诱导的足细胞线粒体ROS生成增加以及ATP含量、膜电位和线粒体DNA拷贝数的下降；过表达PGC-1α逆转Aldo诱导的足细胞表型转变和足细胞损伤,降低Aldo诱导的MMP-9,α-SMA,desmin和α3-integrin以及恢复P-cadherin和nephrin的表达和细胞粘附能力。(2)转基因小鼠中,全身各组织PGC-1α过表达不一致,PGC-1α表达在肾组织中是野生型小鼠的2倍,脾脏升高4倍,肝脏和肺升高约1.5倍。在醛固酮灌注14天后,野生型小鼠PGC-1α mRNA和蛋白水平降低40%,24h尿白蛋白升高至110μg/24h(约正常值5倍,过表达PGC-1α转基因小鼠尿白蛋白升高仅为50μg/24h,醛固酮灌注后检测血尿素氮,肌酐和肾小球滤过率与对照组相比没有明显差异；α3-integrin在野生型小鼠降低70%,nephrin减少50%,而在过表达PGC-1α转基因小鼠可部分逆转α3-integrin、nephrin的减少,desmin在野生型小鼠升高约2倍,转基因小鼠升高1.2倍,WT-1免疫荧光显示野生型小鼠足细胞数目减少40%,而转基因小鼠足细胞数目减少20%。检测线粒体功能发现mtDNA拷贝数和ATP合成、线粒体呼吸链复合物(Ⅰ,Ⅲ和ⅣV)活性在野生鼠中明显减少,而在转基因小鼠这一现象被明显抑制。电镜观察野生小鼠有明显的足突融合,转基因小鼠中足突基本正常,PAS染色显示在野生小鼠中肾小球和系膜有明显扩张,而在转基因小鼠中扩张不明显；结论：PGC-1α过表达可通过保护线粒体功能阻断醛固酮诱导的足细胞损伤。