蜱不仅危害动物健康,更重要的是引起动物多种蜱传疾病,如寄生虫病、病毒病、细菌病、螺旋体病等。许多灭蜱化学药物会造成环境污染、食品安全等问题,新的可持续控制策略急需被发掘和应用。因此,了解蜱分子的生理学功能,研究其在蜱-宿主-病原体关系以及新型防治策略发展十分重要。丝氨酸蛋白酶抑制分子(Serine Protease Inhibitor,Serpin)在生物体内调节内源性蛋白酶平衡、先天性免疫反应、病原传播、食物消化、吸血发育和生殖等多方面具有重要作用,但蜱体Serpin分子的研究还十分有限。因此,本研究将以镰形扇头蜱(R.haemaphysaloides)Serpin分子为对象,重点研究其免疫调节作用和对蜱的生殖功能,为了解Serpin分子在蜱-宿主-病原体的关系研究奠定理论基础。(1)本研究通过课题组已经建立的镰形扇头蜱卵巢转录组数据库,克隆了10条Serpin家族基因,分别命名为RHS2～RHS11,分析其编码的蛋白质理化性质、结构和特征。结果表明,RHS4、RHS5、RHS8为分泌型Serpin,RHS2、RHS3、RHS6、RHS7、RHS9、RHS10为细胞内Serpin;分子模型和蛋白二级结构序列比对显示,10个Serpin分子都具有3个β片层、8～9个α螺旋和RCL组成。(2)应用显微注射和RNA干扰方法,检测RHS2基因干扰后蜱的生殖发育相关基因和蜱生物学特性变化情况。结果显示,RHS2基因随着雌蜱的吸血进程而表达量逐渐增加,在饱血后表达量达到最高值;RHS2基因干扰后,雌蜱24 h上体率显著下降,但对饱血率和产卵率无显著影响;脂肪体中卵黄蛋白原Vg1、Vg2、Vg3的m RNA水平在RHS2干扰后无显著变化。因此,RHS2在蜱的生殖产卵上的功能不显著。(3)通过纯化RHS2重组蛋白,切除标签,并去除内毒素,检测RHS2蛋白对腹腔巨噬细胞活性、RAW264.7巨噬细胞的极化、分泌细胞因子和一氧化氮的情况。结果显示,RHS2可以显著增加巨噬细胞的活性;RHS2可以促进TNF-α和i NOS表达,促进M1型细胞极化;RHS2可以刺激RAW264.7细胞分泌IL-β、IL-6、TNF-α和NO。结果表明,RHS2可以促进巨噬细胞参与的免疫应答。(4)本研究通过分离小鼠脾细胞和体外诱导骨髓源树突状细胞分化,检测RHS2对脾细胞增殖、DCs分化和成熟的影响,以及对T细胞的激活、CTL杀伤、动物血清抗体滴度和亚型的影响。结果显示,在Con A的作用下,RHS2可以促进脾细胞增殖,抑制骨髓源细胞向树突状细胞分化,并抑制DCs的成熟以及CD80、CD86和MHCⅡ的表达;RHS2抑制CD4 T细胞和CD8 T细胞的激活,抑制Th1免疫反应,显著降低IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌;RHS2能够显著抑制CTL杀伤;RHS2与OVA免疫小鼠,血清中的Ig G2b显著降低,Ig M升高,但不影响血清抗体滴度。RHS2在宿主免疫应答的初始阶段、激活阶段和效应阶段均有抑制作用。