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隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种寄生于禽类、哺乳类、两栖类、爬行类、鱼类的重要的人兽共患机会性致病原虫,以腹泻为主要特征,可导致包括人类在内的260多种动物诱发隐孢子虫病。微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）是隐孢子虫病的主要病原。最初采用的诊断隐孢子虫病的方法是对肠黏膜或粪便中的可疑卵囊进行检查;随着研究的不断深入与进步,免疫荧光试验、间接血凝试验、ELISA等血清学试验已用于试验检测隐孢子虫抗原的报道。为建立用于检测微小隐孢子虫的夹心ELISA方法,进行了如下的试验。首先优化和改进了纯化微小隐孢子虫卵囊方法。通过微小隐孢子虫IId亚型感染新生荷斯坦公犊牛进行卵囊扩增,观察排卵囊规律和临床表现,发现排卵高峰期在第5-7天,显露期为17天;收获的卵囊量高达3.5亿;由于犊牛粪便富含的脂类影响卵囊的收获,首先对粪便中脂肪采用水-乙醚沉淀法按照1:1体积比进行除脂,该法所形成脂肪层稳定,在显微镜下观察,视野纯净、初步纯化的卵囊样品杂质显著减少。将所获得到的卵囊分别用饱和蔗糖溶液漂浮、饱和硫酸锌漂浮及饱和食盐水漂浮法进行纯化,结果发现:饱和蔗糖溶液漂浮法漂浮上来虽然卵囊数量较多,但进行下一步氯化铯密度梯度离心时,卵囊带不明显,不利于吸取卵囊带进行下一步卵囊的浓缩;饱和硫酸锌法纯化处理的卵囊夜浓缩后放置一段时间后会出现絮状沉淀,杂质太多;饱和食盐水漂浮法纯化的卵囊在显微镜下观察视野清晰,杂质少,可作为微小隐孢子虫抗原用纯化方法;最后一步使用氯化铯密度梯度离心法进行纯化,所获得的卵囊量大且杂质少。优选后的微小隐孢子虫纯化采取水-乙醚除脂、饱和盐水漂浮、氯化铯密度梯度离心三步法为最佳。随后制备鉴定了抗微小隐孢子虫IgG和IgY。将纯化的隐孢子虫卵囊计数后,经过液氮和37℃反复冻融、超声波处理,离心上清作为检测性抗原,沉淀作为免疫性抗原。分别多次免疫健康家兔和120日龄开产健康海兰蛋鸡,制备多克隆抗体IgG和IgY。用盐析法分离纯化IgG、水稀释二步硫酸铵法分离纯化卵黄抗体（Immunoglobulin of egg yolk,IgY）。建立了检测IgY效价的间接ELISA方法,检测纯化的兔抗微小隐孢子虫血清抗体IgG和鸡抗微小隐孢子虫卵黄抗体IgY,效价分别为1:51200和1:12800。最后建立了夹心ELISA方法并进行初步应用。以IgG为捕获抗体,IgY为检测抗体进行夹心ELISA方法（sandwich enzyme-linked immunosorbent assay）的建立。建立的夹心ELISA方法捕获抗体IgG的最佳包被浓度是1:800,包被时间为37℃作用1h后4℃过夜;最佳抗原浓度是2.5μg/mL;检测抗体IgY的最佳稀释度为1:100,最佳反应时间为30min;酶标抗体最佳工作浓度为1:5000,最佳反应时间为45min;TMB室温显色10min;最佳终止条件是2mol/L H2SO4,50μL/孔;特异性检测发现,本试验建立的夹心ELISA方法与球虫卵囊,圆线虫和绦虫虫卵无交叉反应,特异性好;批内和批间变异系数均小于10%,重复性佳。从长春某养殖场采集108份猪的粪便样品,作为初步应用的检测样本。为保证检测效果,用同批粪便样品采用平行提取DNA、扩增18SrRNA进行分子检测的方法评估了饱和蔗糖溶液漂浮、饱和食盐水漂浮和PBST洗涤剂洗涤3种方式处理待检粪便样品对检测结果的影响。结果发现,三种方法处理的粪便样品用夹心ELISA检测与nested-PCR检测结果总符合率分别为95.83%、91.67%和83.33%,表明饱和蔗糖溶液漂浮法检测样品的效果最好。故当进行临床样品的检测时,先用饱和蔗糖溶液漂浮法处理粪便样品,然后用建立好的夹心ELISA检测样本。试验结果证实,该方法简便,快速,敏感,可作为临床微小隐孢子虫批量检测或流行病学调查的优选方法。