环境中痕量溴系阻燃剂的新型免疫分析方法的研究

来源 :上海交通大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shen888
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溴系阻燃剂(BFRs)是目前阻燃效率最高的有机阻燃剂之一,能够满足于多种阻燃产品的使用要求。多溴联苯醚(PBDEs)属于溴系阻燃剂的一种,因其阻燃效率高,热稳定性好而被广泛应用于聚合物的生产中。其中,2,4,4’-三溴联苯醚(BDE-28)与2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)均为检出率较高的PBDEs同系物,具有很强的生物毒性。四溴双酚A(TBBPA)是一种常用的工业溴系阻燃剂,常因高温或其他理化因子的影响而释放到环境介质中。目前,BFRs的检测方法以气相或液相色谱为主,这类色谱检测技术具有较高的稳定性和准确度,但其检测周期长,样品前处理过程复杂且仪器的维护费用昂贵。因此,建立高灵敏度、高通量、方便快捷的免疫分析方法检测痕量BFRs在环境监测研究领域具有重要的科学意义和应用价值。本论文分别以BDE-28、BDE-47和TBBPA三种检出率较高的BFRs作为研究对象,利用BDE-28、BDE-47和TBBPA人工抗原及多克隆抗体,建立了三种新型免疫分析方法,并分别应用于环境样品的检测。对于建立高灵敏度、快速便捷的免疫分析方法检测痕量BFRs具有一定的参考作用。具体研究结果分别如下:(1)本研究首先设计合成了含氨基活性官能团的BDE-28半抗原,并分别利用傅里叶变换红外光谱、核磁共振氢谱和紫外-可见吸收光谱进行表征,验证BDE-28半抗原的分子结构,然后分别采用不同的方法将BDE-28半抗原与牛血清白蛋白(BSA)及卵清白蛋白(OVA)偶联,制备BDE-28人工免疫原及包被原。最后,以新西兰大白兔为免疫对象,利用BDE-28人工免疫原连续数次的免疫,所制备的BDE-28多克隆抗体(pAb-BDE-28)特异性强,与BDE-28结构类似物的交叉反应率均小于10%。pAb-BDE-28的效价达到64000倍以上,且其亲和常数高达2.53×107 M-1,能够满足后续免疫分析实验的要求。(2)用生物素-N-羟基琥珀亚胺酯(BNHS)标记的羊抗兔IgG修饰金纳米颗粒(GNPs),建立了检测TBBPA的基于功能化金纳米的间接竞争BA-ELISA方法(GNPs-BA-ELISA)。实验分别考察了不同试剂浓度及基质效应的影响。以TBBPA浓度的对数值为横坐标、以抑制率的检测值为纵坐标建立检测TBBPA的GNPs-BA-ELISA方法的标准曲线。在最优反应条件下,TBBPA浓度为0.009μg/L-3.126μg/L时,线性关系良好,线性方程:y=23.58logC0+68.33(R2=0.9879),灵敏度IC50为0.167μg/L,检测下限为0.0034μg/L;加标样品回收率为89.22%-107.91%,变异系数为6.23%-11.73%。GNPs-BA-ELISA方法检测TBBPA的板内和板间变异系数均小于13%。所建立的GNPs-BA-ELISA方法检测PM2.5及农田土壤样品中TBBPA的结果与HPLC方法具有较好的相关性(R2=0.9887)。与BA-ELISA方法比较,GNPs-BA-ELISA方法的灵敏度提高了3-4倍。(3)利用BNHS标记的羊抗兔IgG修饰氧化石墨烯载体,制备功能化的氧化石墨烯载体,再以BNHS作为生物素衍生试剂标记DNA片段制备生物素化DNA,分别建立检测BDE-28、BDE-47的基于功能化氧化石墨烯的间接竞争BA-iPCR方法(GO-BA-iPCR)。实验优化了各检测试剂的浓度,并考察检测体系中不同基质条件的影响。以分析物浓度的对数值为横坐标,以PCR扩增结果的Ct值为纵坐标,分别建立了检测BDE-28、BDE-47的GO-BA-iPCR方法的标准曲线。最优反应条件下,BDE-28浓度为5 pg/L-50000 pg/L时,线性相关性较好,线性方程为Ct=0.32logC0+12.63(R2=0.9756),检测下限为1.27pg/L,加标样品回收率为90.75%-107.74%,变异系数为3.65%-9.73%。BDE-47浓度为1 pg/L-10000 pg/L时,线性关系良好,线性方程为Ct=0.24logC0+14.05(R2=0.9839),检测下限为0.72 pg/L,加标样品回收率为91.67%-109.06%,变异系数为3.82%-11.06%。GO-BA-iPCR方法检测BDE-28及BDE-47的板内和板间变异系数均小于13%。利用GO-BA-iPCR检测PM2.5样品中的BDE-28、BDE-47,与GC-MS检测结果具有较好的相关性(BDE-28:R2=0.9868,BDE-47:R2=0.9877)。(4)用人工多克隆抗体和条形码DNA修饰金纳米颗粒,制备抗体IgG-GNPs-条形码DNA复合物作为生物探针,分别建立检测BDE-28、BDE-47的基于金纳米生物探针的直接竞争免疫PCR方法(GNPs-iPCR)。实验优化了人工包被原-生物探针结合的浓度量比。以分析物浓度的对数值为横坐标,以PCR扩增结果结果的Ct值为纵坐标,分别建立了检测BDE-28、BDE-47的GNPs-iPCR方法的标准曲线。在最优反应条件下,BDE-28浓度为6 pg/L-60000pg/L时,线性相关性良好,线性方程为Ct=0.54logC0+10.92(R2=0.9881),检测下限为1.67 pg/L,加标样品的回收率为89.60%-109.91%,变异系数为4.25%-11.71%;BDE-47浓度为5 pg/L-50000 pg/L时,线性相关性良好,线性方程为Ct=0.43logC0+12.57(R2=0.9865),检测下限为1.32 pg/L,加标样品的回收率为87.97%-107.90%,变异系数为3.70%-11.22%。GNPs-iPCR方法检测BDE-28及BDE-47的板内和板间变异系数均小于10%。GNPs-iPCR方法的灵敏度与GO-BA-iPCR接近,但其检测周期短,重复性更好,准确度更高。利用GNPs-iPCR检测不同环境介质样品中(PM2.5、沉积物及农田土壤)的BDE-28、BDE-47,与GC-MS的检测结果具有较好的相关性(BDE-28:R2=0.9879,BDE-47:R2=0.9897)。本文所建立的三种新型免疫分析方法中,环境样品在正常萃取后不需要预浓缩甚至纯化过程,近百个样品均可以在8 h内完成检测,检测水平达到了ng/L或pg/L的级别。所建立的GNPs-BA-ELISA、GO-BA-iPCR、GNPs-iPCR方法灵敏度高、稳定性好、方便快捷,分析物的检测值与HPLC、GC-MS结果具有较好的相关性,可完成不同环境介质中痕量BFRs的快速高通量检测。
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