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背景和目的头颈部肿瘤(head and neck cancer,HNC)是世界范围内第六大常见的恶性肿瘤,位居肿瘤相关死亡原因第八位。90%以上的HNC属于由粘膜上皮发展形成的鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC),恶性程度较高,在癌症早期即可浸润转移至远端组织器官。目前,HNC临床治疗以患者发病部位和肿瘤浸润转移分级为基础,大多采用手术、放疗和化疗等治疗策略。虽然近几年,手术、化疗和放疗已取得很大进展,但是临床上HNC患者的生存率和生活质量并没有得到显著改善。因此,急需开发针对HNC新型的治疗方案。目前,生物治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四种最有效的肿瘤治疗策略。其中,复制选择性溶肿瘤腺病毒(replication-selective oncolytic adenovirus,RSOA)是肿瘤生物治疗研究中发展较快、极具前景的一种新型抗肿瘤药物。以RSOA为载体的病毒免疫基因治疗不仅可以发挥溶肿瘤病毒自身对肿瘤细胞的裂解、杀伤作用,而且可以通过基因工程技术插入外源免疫调节基因,使其随着病毒的选择性复制,在肿瘤组织局部高表达,从而增强RSOA抗肿瘤作用。2005年,我国首次批准了世界上第一个溶肿瘤腺病毒药物H101(上海三维公司),在临床上主要用于HNC的治疗。越来越多的研究结果提示RSOA有望成为下一个最具突破性的肿瘤免疫治疗方法。白介素-12(Interleukin-12,IL-12)是最具抗肿瘤潜能的细胞因子之一,通过对肿瘤微环境中不同的免疫细胞产生多重效应,成为连接先天性免疫和适应性免疫的桥梁。IL-12持久有效的抗肿瘤反应往往伴随严重的血液学毒性,因此,需要研究有效的策略,降低IL-12系统性表达。基于此,本实验室前期构建了表达非分泌型IL-12(Non-secreting IL-12,ns IL-12)的新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001(Ad-TD-ns IL-12),即以Ad-TD(专利号ZL200910066130.4)为骨架病毒,采用基因工程技术,在腺病毒基因组中插入ns IL-12基因。在前期胰腺癌动物模型中证实Bio TTT001具有高效、低毒的抗肿瘤效果。免疫缺陷小鼠荷人源移植瘤模型,因为其不能支持人5型腺病毒(Adenovirus5,Ad5)复制,所以无法全面评价溶肿瘤腺病毒的安全性和有效性,而且也无法研究溶肿瘤腺病毒对机体免疫系统的影响。与小鼠类动物模型相比,叙利亚仓鼠支持Ad5复制,因此作为支持腺病毒复制的免疫健全的动物模型广泛应用于溶肿瘤腺病毒的研究中。为了研究新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001对HNC的治疗作用,本课题通过一系列体外和体内实验,分析Bio TTT001在HNC细胞中的复制、杀伤能力以及在叙利亚仓鼠HNC皮下移植瘤模型中的抗肿瘤效果,初步探讨其抗肿瘤作用机制,该研究为Bio TTT001的临床转化奠定基础。第1章新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001体外抗肿瘤能力的研究方法1.采用不含抗生素的LB液体细菌培养基,37℃过夜摇菌,检测该课题所用病毒是否存在细菌污染;采用聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR),利用支原体特异性引物,检测病毒是否存在支原体污染。2.采用结晶紫染色法、MTS法及流式Annexin V-FITC/PI双染色法,检测新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001对不同肿瘤细胞的杀伤作用以及对细胞凋亡水平的影响。3.采用半数组织培养感染剂量法(50%tissue culture infective dose,TCID50)和酶联免疫反应方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测Bio TTT001在肿瘤细胞中的复制能力及人IL-12(human IL-12,IL-12)表达水平。4.统计学处理:实验数据采用Graphpad Prism 5.0进行分析处理,对于多个样本的均数比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)并进行多重比较检验(Tukey’s multiple comparison test),P<0.05表示具有统计学差异。结果1.本课题所用新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001、骨架病毒Ad-TD-Luc及对照病毒dl1520均不存在细菌和支原体污染。2.叙利亚仓鼠HNC细胞HCPC I及人鼻咽癌细胞C666-1感染三种病毒后,细胞发生不同程度的病变,HCPC I及C666-1细胞EC50值显著低于SCC7;新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001在多种不同来源的人肿瘤细胞中的EC50值小于0.5。病毒感染48h,HCPC I细胞及C666-1细胞均发生不同程度的凋亡,而小鼠鳞状细胞癌SCC7则无明显凋亡。3.新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001的复制能力与对照病毒dl1520相似;病毒在C666-1细胞中的复制水平在48h即可达到峰值,而在HCPC I细胞中复制水平较低,随感染时间的延长逐渐升高。h IL-12在HCPC I和C666-1均有表达,表达量随感染时间的延长而逐渐升高。多种不同组织来源的人肿瘤细胞均支持h IL-12表达。第2章新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001体内抗肿瘤效果及机制的研究方法1.分别将5.0×106和1.0×107 HCPC I细胞接种于叙利亚仓鼠右侧背部皮下,观察并测量皮下肿瘤形成的时间及大小;采用苏木素-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察肿瘤组织内部细胞形态。2.将1.0×107 HCPC I细胞接种于叙利亚仓鼠右侧背部皮下,当肿瘤体积达到350mm3时,进行分组,分别为PBS、dl1520、Ad-TD-Luc和Bio TTT001组,每组7只,进行瘤内治疗;第一个动物实验采用2.0×108PFU病毒,六次连续治疗,即d1、2、3、4、5和6;第二个动物实验采用2.0×108PFU病毒,六次间隔治疗,即d1、3、5、7、9和11;第三个动物实验采用5.0×107PFU病毒,六次间隔治疗,即d1、3、5、7、9和11;每周测量两次肿瘤体积大小,采用Graphpad Prism 5.0绘制肿瘤生长曲线。3.将1.0×107HCPC I细胞接种于叙利亚仓鼠右侧背部皮下,当肿瘤体积达到350mm3时,分为四组,即PBS、Ig G、GK1.5和4F11组,分别腹腔注射PBS、对照抗体Ig G、删除抗体4F11(抗CD3抗体)和删除抗体GK1.5(抗CD4抗体);24h后,瘤内注射PBS或Bio TTT001(5.0×107PFU病毒,d1、3、5、7、9和11);每周注射两次抗体,至实验结束。4.经过Bio TTT001治疗后,皮下肿瘤完全清除的叙利亚仓鼠,在其左侧重新接种两倍剂量的HCPC I细胞(2.0×107),同时腹腔注射删除抗体4F11,观察肿瘤细胞二次接种后的成瘤情况。5.统计学处理:实验数据采用Graphpad Prism 5.0进行分析处理,对于多个样本的均数比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)并进行多重比较检验(Tukey’s multiple comparison test),P<0.05表示具有统计学差异。结果1.皮下接种1.0×107HCPC I细胞成瘤效果优于低剂量5.0×106;HE染色后,肿瘤组织呈现典型的肿瘤结构形态。2.在叙利亚仓鼠HNC皮下移植瘤模型治疗中,瘤内间隔治疗,其抗肿瘤效果优于连续治疗;降低病毒治疗剂量后,Bio TTT001治疗组肿瘤清除率达到85.7%,抗肿瘤效果显著优于骨架病毒和对照病毒。3.删除叙利亚仓鼠体内CD4+T淋巴细胞后,新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001依然具有较强的抗肿瘤作用,而删除CD3+T淋巴细胞后,Bio TTT001抗肿瘤作用则显著降低。4.新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001治疗后,皮下肿瘤完全清除的叙利亚仓鼠左侧背部皮下再次接种HCPC I细胞,不能再次成瘤;而同时接受腹腔注射4F11抗体的叙利亚仓鼠,则可以再次成瘤,且肿瘤生长迅速。结论1.新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001对叙利亚仓鼠HNC细胞HCPC I及人鼻咽癌细胞C666-1敏感程度高于小鼠鳞状细胞癌细胞,且对一系列人源肿瘤细胞有很强的杀伤作用,有望在临床上用于多种不同肿瘤的治疗。2.溶肿瘤腺病毒瘤内间隔治疗,其抗肿瘤效果优于连续治疗;新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001能够有效地抑制叙利亚仓鼠HNC皮下移植瘤的生长,且抗肿瘤效果显著优于第一代溶肿瘤腺病毒dl1520。3.新型溶肿瘤腺病毒Bio TTT001可以引发机体长期的抗肿瘤免疫保护作用,且Bio TTT001发挥抗肿瘤作用主要由CD3+T淋巴细胞所介导。