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目的:利用基因工程技术将干扰素-γ诱导蛋白10(IP10)和T细胞受体互补决定区3(CDR3)与针对间皮素的单链可变片段(scFv)融合在一起,构建融合蛋白IP10-CDR3-scFv,并检测融合蛋白在人卵巢癌细胞株SKOV3中的表达。利用原核表达系统诱导融合蛋白IP10-CDR3-scFv的表达,并对表达蛋白进行分离、纯化和鉴定,实现目的蛋白的大量制备,在体外验证其与SKOV3细胞的结合能力,为融合蛋白的抗肿瘤研究奠定实验基础。方法:1、通过人工合成法将IP10和CDR3与scFv基因通过Linker连接,用双酶切法将构建的IP10-CDR3-scFv克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,并验证重组表达载体的准确性。2、pcDNA3.1-IP10-CDR3-scFv质粒转染卵巢癌SKOV3细胞,用实时定量PCR检测IP10、CDR3的mRNA表达水平,Western blot检测融合蛋白的表达。3、构建IP10-CDR3-scFv蛋白的原核表达载体pET28a-IP10-CDR3-scFv,并对重组载体双酶切鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主菌,使用IPTG诱导融合蛋白表达,并对IPTG诱导表达的条件进行优化,SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况。融合蛋白经纯7化和复性后,用Western Blot对融合蛋白进行鉴定分析。4、将FITC标记的融合蛋白与SKOV3作用后,流式细胞术检测融合蛋白与SKOV3细胞的结合能力。结果:1、pcDNA3.1-IP10-CDR3-scFv质粒经HindIII及Eco RI酶切后用1%琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示目的条带位置与预期基本一致,经测序正确,表明构建的重组真核表达载体是正确的。2、IP10-CDR3-scFv质粒转染SKOV3细胞48h后,检测IP10、CDR3的转录水平和带His标签的融合蛋白的表达:(1)实时定量PCR结果显示,与未转染组和仅pcDNA3.1(+)转染组相比,pcDNA3.1-IP10-CDR3-scFv转染组的IP10、CDR3的转录水平明显升高,且表达量差异具有统计学意义(p<0.05)。(2)Western blot实验结果显示,pcDNA3.1-IP10-CDR3-scFv转染组有融合蛋白的表达,分子量约为45kD。3、利用原核表达系统,成功诱导了融合蛋白表达,并对融合蛋白进行纯化和Western blot鉴定:(1)原核表达载体pET28a-IP10-CDR3-scFv经酶切和测序鉴定,证明构建成功。(2)重组质粒转化至BL21(DE3)表达菌株,用IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE分析结果表明,以未诱导组为对照,发现在45kD处诱导表达出融合蛋白。(3)通过温度(37℃与15℃)和IPTG浓度(终浓度为0.2mM和1.0mM)的不同条件进行诱导,经SDS-PAGE分析,IPTG在37℃0.2mM诱导条件下,融合蛋白表达量最大,且各诱导条件下目的蛋白均以包涵体形式存在。(4)用37℃0.2mM IPTG诱导条件进行大量诱导表达,包涵体清洗后经Ni柱纯化复性得到高纯度融合蛋白,WB鉴定分析证明IPTG诱导表达的蛋白为IP10-CDR3-scFv融合蛋白。4、流式细胞术实验结果显示,与SKOV3组(0.20±0.01%)相比,SKOV3+IP10-CDR3-scFv组FITC标记的融合蛋白与SKOV3细胞的结合率为6.54±0.08%,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:本研究成功构建了IP10-CDR3-scFv重组表达载体,融合蛋白IP10-CDR3-scFv可在卵巢癌细胞株SKOV3中获得表达。通过原核诱导表达实现了融合蛋白的大量制备,Western blot验证诱导和纯化的蛋白为IP10-CDR3-scFv融合蛋白,并且该蛋白可与SKOV3细胞结合。