论文部分内容阅读
本课题组在前期研究中克隆了玉米大斑病菌Fus3/Kss1-homolog MAPK级联途径下游核心转录因子StSte12的基因，并获得了3株不同沉默程度的RNAi转化子，通过对转化子的分析发现，该基因参与调控病菌的致病过程，但其具体的调控的机制尚不清晰。本研究利用基因敲除及过表达技术获得了StSTE12基因敲除及过表达突变体，通过对突变体的分析，明确了该转录因子的亚细胞定位;利用生物信息学技术鉴定了可能受StSte12调控的几丁质合酶基因家族，并利用Real-time PCR技术发现其中3个基因可能受该转录因子的正调控;利用染色质免疫共沉淀技术确定了StSte12作用的靶基因，并明确了在该基因的结合位点。主要研究结果如下: 1.利用PEG介导的原生质体转化方法，将StSTE12基因过表达载体转化玉米大斑病菌野生型菌株01-23，通过草胺磷抗性筛选、GFP荧光检测、特异引物PCR及Real-time PCR验证，获得了2株StSTE12基因过表达突变体。 2.以pBS-pUC质粒为基本骨架，构建了玉米大斑病菌StSTE12基因敲除载体，通过PEG介导的原生质体转化方法转化野生型菌株01-23，通过潮霉素B抗性筛选、特异引物PCR及RT-PCR验证，筛选得到了2株StSTE12基因敲除突变体。 3.通过对StSTE12基因过表达突变体细胞内GFP荧光观察，并结合DAPI染色方法，确定了StSte12亚细胞定位于细胞核中。 4.利用生物信息学方法，在玉米大斑病菌基因组数据库中鉴定出几丁质合酶基因家族，该家族包含8个与几丁质合成相关的基因StCHS1-StCHS8;利用Real-time PCR技术分析了这8个基因在野生型菌株、StSTE12基因敲除及过表达突变体菌株中的表达情况，结果发现，与野生型菌株相比突变体中StCHS3、StCHS5、StCHS7基因的表达量均表现出显著差异，并且在StSTE12基因的敲除突变体中表达量显著降低，在过表达突变体中显著升高，表明这3个几丁质合酶基因很可能受StSte12转录因子的正调控。 5.利用染色质免疫共沉淀技术(ChIP)确定了StCHS5为受StSte12转录因子调控的靶基因;进一步利用qPCR技术对StCHS5的启动子区分析发现StSte12在该基因的结合位点序列为TGAAACG。 6.利用Real-time PCR的方法分析了玉米大斑病菌中几丁质合酶基因StCHS5在不同发育时期的表达情况，结果发现StCHS5基因在芽管、附着胞以及侵入丝时期表达量相对较高。