论文部分内容阅读
丙酮酸是生物代谢过程中承上启下的关键中间产物,为糖酵解途径的产物,同时它为糖酵解途径(EMP)和三羧酸循环(TCA)提供原料,丙酮酸可经多路途径产生甲酸、乙酸、苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸和丙氨酸等物质,并且为生物的各项生命活动提供所需的能量。野生型大肠杆菌发酵不会积累丙酮酸,然而对大肠杆菌进行代谢工程改造后,譬如lpdA基因敲除后的大肠杆菌可以积累丙酮酸。本文重点考察了lpdA基因敲除大肠杆菌(Escherichia coli lpdA-)在不同糖为碳源积累丙酮酸的情况,并通过优化培养基组成提高lpdA突变菌产丙酮酸的生产效率。在此基础上,考察了胞内NADH/NAD+值与丙酮酸积累之间的关系,以及呼吸链末端氧化酶cyoA和cydB基因敲除对大肠杆菌生长,代谢途径上的影响,结果如下：在线控制pH为7.0,好氧条件下对lpdA突变菌利用不同糖原进行分批发酵,葡萄糖,果糖、木糖和甘露糖都可以被lpdA突变菌在基本培养基中利用,并积累大量丙酮酸,得率分别达到了0.884g/g,0.802g/g、0.817g/g和0.808g/g,并且丙酮酸的积累在葡萄糖、果糖和木糖发酵过程属于生长偶联型,甘露糖发酵产丙酮酸过程属于部分偶联型发酵。基本培养基混合1%,5%,10%和20%LB培养基组成下,lpdA突变菌发酵葡萄糖生产丙酮酸的能力,发现10%的LB添加量是lpdA突变菌发酵较为合适的条件。在此条件下,10g/L葡萄糖发酵结束所需时间由不加LB培养基时的71h缩短至12h,生产效率由0.080g·L-1·h-1提高到0.525g·L-1·h-1提高了556%。核黄素、吡哆醇和烟酸的适量补充也能提高丙酮酸生产效率。在大肠杆菌中,较低的NADH/NAD+值有利于丙酮酸的积累以及减少副产物的生成。进一步分析发现,对于lpdA突变菌而言,NADH/NAD+值与丙酮酸得率有关,而与生产效率无关。大肠杆菌cydB突变菌在合成培养基分批发酵时,进入对数生长期后,细胞快速生长,最终细胞浓度达到5.5g/L,比野生型大肠杆菌BW25113高约35%。酶活检测结果说明该情况下TCA循环相关酶活性的显著增加,说明大肠杆菌cydB基因的敲除激活了TCA循环,促进细胞生长,提高工程菌发酵效率。