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毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)和芽囊原虫(Blastocystis sp.)是三种重要的人兽共患的机会性致病性肠道原虫,感染呈全球分布。原虫的孢子、卵囊及包囊在环境中广泛存在,人或动物接触感染后,会引起宿主微孢子虫病、隐孢子虫病和芽囊原虫病,严重危害着宿主的健康,给畜牧业造成严重的经济损失。我国猪的养殖在家畜中所占比例较高,我国人民主要的肉食来源也是猪肉,且占日常肉类消费的60%以上,但有关这三种原虫在中国的家猪以及藏猪的分子流行病学研究、基因型鉴定以及遗传学特征的报道还不够全面。 本研究采用特异性巢式 PCR 技术对我国浙江省、广东省和云南省的家猪的微孢子虫、隐孢子虫和芽囊原虫以及西藏自治区的藏猪的微孢子虫的分子流行病学特征及虫种/基因型和亚型进行鉴定。结果显示:家猪微孢子虫的总体感染率为 31.57%(125/396),隐孢子虫的总体感染率为 17.68%(70/396),芽囊原虫的总体感染率为42.93%(170/396)。其中芽囊原虫的感染率明显比微孢子虫和隐孢子虫的感染率高,因此可以推断在这三个地区中,家猪感染的肠道原虫的优势虫种为芽囊原虫。通过毕氏肠微孢子虫核糖体内部转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)的序列分析得知,125个毕氏肠微孢子虫PCR阳性样本中鉴定出15个基因型,包括9个已知的基因型(EbpC,EbpA,D,G,H,pig EBITS5,Henan-IV,KIN-1,CHS5)和6个新基因型(GD1,ZJ1,ZJ2,YN1,YN2 和 YN3)。通过 ITS 序列的系统进化分析显示,本研究鉴定出的6个新基因型和已知基因型EbpC,EbpA,D,G,H,pig EBITS5, Henan-IV,KIN-1和CHS5均位于具有人兽共患可能性的进化组Group 1中。通过隐孢子虫小亚基核糖体RNA(small subunit ribosomal RNA, SSU rRNA)基因的序列分析,从70个隐孢子虫PCR阳性样本中共鉴定出1个虫种/基因型,该基因型为猪隐孢子虫基因Ⅱ型(C. scrofarum,70/130)。最后通过牙囊原虫SSU rRNA基因的序列分析证明,在150个PCR阳性样本中,共鉴定出两个基因型,分别为ST1和ST5,通过系统进化分析发现两个基因型均存在人畜共患可能性。通过上述方法对藏猪的微孢子虫进行感染率评估和基因型鉴定。通过ITS序列分析显示,成功检测出41个微孢子PCR阳性,并鉴定出6个基因型,包括4个已知基因型EbpC,EbpD,pigEBITS5, CHS12和2个新基因型GB11 和GB31。通过系统进化分析发现,西藏自治区藏猪的微孢子虫均具有人畜共患的潜力。 本研究还应用多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)技术对所鉴定出的家猪毕氏肠微孢子虫阳性DNA样本进行基因亚型鉴定。结果显示,共4个ITS基因型(3个EbpC和1个Pig-EBIST5)的分离株在全部4个位点(3个微卫星位点:MS1,MS3,MS7和1个小卫星位点MS4)测序成功,共检测出4种新的多位点基因型(MLG novel1-4),显示出微孢子虫的遗传多样性。该研究结果显示出ITS序列在相同基因型中的分析能力不足。本研究基于已建立的 MLST 分型方法,对所鉴定出的藏猪毕氏肠微孢子虫阳性DNA样本进行多位点序列分型,结果显示只有2个相同的ITS基因型EbpC的分离株在全部位点测序成功,共鉴定出两个新的基因型(MLGⅠ和 MLGⅡ)。所以,具有高分辨率的 MLST 分型方法可以在今后的研究中使用,以此来评估所鉴定出的分离株的人兽共患可能性以及追踪其感染来源和传播机制等科学问题。 最后,用统计学软件 (SAS version 9.1)对3种肠道原虫(微孢子虫、隐孢子虫和牙囊原虫)进行了风险因素的分析。在单个因素分析中,通过计算比值比(OR, odds ratio)及其95%CI(confidence interval),发现年龄(幼龄动物)、性别(公和母)和地区(省份)这3个因素均会增加猪感染肠道原虫病的风险。 综上所述,本研究对我国部分地区猪及藏猪的三种重要的人畜共患肠道原虫从感染率、基因型或亚型鉴定进行分析,并评估了分离株的人兽共患风险性。本研究还运用更精确的 MLST 分型方法对我国南方地区的家猪和西藏地区的藏猪毕氏肠微孢子虫进行多位点序列分型,获得了更为丰富的遗传学信息。另外,本研究首次采用MLST分型工具对浙江省、广东省和云南省的家猪及西藏自治区的藏猪微孢子虫病进行遗传学评估,研究结果为预防和控制家畜微孢子虫感染提供了基础数据。