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兰科植物是开化植物中最大的家族之一,在全世界共有800余属3万多种原生种。兰花是珍贵的的观赏花卉,有极高的观赏价值和经济价值。石斛兰是是兰科中最大的属,主要生长在热带地区。本研究应用基因工程手段把抗冻蛋白基因导入石斛兰中,进行石斛兰品质改良,培育抗冻石斛兰新材料,为石斛兰的北移提供可能。 本研究以石斛兰(Dendrobium Madame Thong-In)为试验材料,研究了不同外植体、不同激素浓度配比对石斛兰愈伤组织、不定芽和根诱导的影响。优化了石斛兰再生条件,获得了石斛兰嫩芽高效再生体系。试验结果表明,以石斛兰芽为外植体,其再生能力明显高于其他外植体,并筛选出诱导愈伤组织、不定芽和根的最佳培养基。研究中发现,切除叶的芽接种在MS+2,4-D1.0mg/L+NAA2.0mg/L+KT1.0mg/L+椰子水5.0%+蔗糖3%+琼脂粉5.5g/L的培养基上,经过1周左右开始出现愈伤组织,并且愈伤组织的诱导率高达90%;把愈伤组织接种到MS+BA1.5mg/L+NAA0.2 mg/L+GA1 mg/L+椰子水5%+蔗糖3%+琼脂粉5.5g/L的培养基上诱导不定芽再生,25天左右可看到不定芽的长出,诱导率达82.0%;再生芽在1/2MS+IBA0.5 mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖2%+琼脂粉5.5g/L的生根培养基上经过30天左右可诱导出根,生根率可达90%。石斛兰高效再生体系的建立,完全可以满足遗传转化的需要。 建立石斛兰高效再生体系后,进行了测定愈伤组织对Kan的抗性,在此基础上,利用农杆菌介导法和基因枪介导法的遗传转化法进行遗传转化的研究。试验结果表明:石斛兰愈伤组织对Kan的敏感浓度为150mg/L。① 利用农杆菌介导法进行遗传转化的研究中发现预培养时间、共培养时间、是否添加乙酰丁香酮对石斛兰的遗传转化率均有较大影响。得出预培养2天、共培养36～48h,添加100mg/L的乙酰丁香酮的遗传转化率最高。共培养后转至MS+BA1.5 mg/L+NAA0.2 mg/L+GA1 mg/L+椰子水5%+蔗糖3%+琼脂粉5.5g/L+Car300 mg/L+Kan150mg/L培养基上进行分化筛选培养,3个月后,经过4～6次筛选的抗性愈伤组织部分分化出芽。转到1/2MS+IBA0.5+活性炭0.5g/L+蔗糖2%+琼脂粉5.5g/L+Car150mg/L+Kan150mg/L进行生根筛选。② 利用基因枪法进行遗传转化的研究中,预培养时间、轰击距离对石斛兰的遗传转化率有较大影响。确定了基因枪转化石斛兰的有