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水杨酸(salicylic acid,SA)是植物九大类激素之一,在植物抗病、种子萌发、气孔开闭、根瘤形成、DNA损伤修复以及叶片衰老等方面发挥了重要功能。水杨酸3-羟化酶(salicylic acid 3-hydroxylase,S3H)和水杨酸5-羟化酶(salicylic acid5-hydroxylase,S5H)是拟南芥(Arabidopsis thaliana)SA代谢途径关键酶,能够催化SA羟基化分别生成2,3-二羟基苯甲酸(2,3-dihydroxybenzoic acid,2,3-DHBA)和2,5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid,2,5-DHBA),进而调节植株内源SA水平。在我们的早期研究中,通过序列比对和系统进化树分析,发现一个拟南芥羟化酶基因S5H的同源基因DLO2(At4g10490),体外酶活分析结果显示DLO2能够催化SA生成2,5-DHBA。然而,DLO2的生化功能和生物学功能还不是很清楚,仍有待进一步阐明。本研究通过分子生物学和生理生化等技术手段,对SA羟化酶基因DLO2功能展开进一步探索,同时利用35S启动子和S5H启动子分别驱动S3H在野生型拟南芥过量表达创制了低SA含量的遗传学材料,取得的研究结果如下:(1)DLO2重组蛋白纯化和酶活检测。利用亲和层析分离纯化DLO2重组蛋白,大小为75 kD,与预期结果一致。纯化后的蛋白DLO2以SA为底物进行酶活反应。结果表明:与S5H类似,DLO2也能以SA为底物,催化生成2,5-DHBA;在不同pH、温度条件下对DLO2酶活进行测定,发现DLO2酶活反应最适pH为7.0,最适温度为20℃;在最适条件下,测定DLO2的Vmax值为65.6±4.0 nmol mg-1 h-1,Km值为31.4±4.3μM。(2)DLO2表达模式分析。以S5H基因作为对照,利用荧光定量PCR检测了DLO2在不同发育时期和不同组织中的表达情况。结果表明:DLO2和S5H在衰老叶片中表达量较高,而在未衰老叶片中表达量较低,且趋势基本一致;在不同组织中,DLO2与S5H基因在茎中表达量最高,其次是花,在果荚中表达量最低。此外,DLO2基因在不同时期、不同组织中表达量均极显著低于S5H。外源SA处理、病原菌Pst DC3000(Pseudomonas syringae)侵染、冷胁迫等条件下,S5H表达有一定上调,与S5H基因不同,DLO2在处理前后表达量无明显变化。在s3hs5h双突变体及低SA含量NahG材料中检测两种基因表达,结果表明S5H表达受SA诱导,而DLO2表达不受SA诱导。(3)不同背景下dlo2突变体表型观察及代谢测定。s5hdlo2双突变体莲座叶表型变小,游离SA以及总SA的水平上升,但在Col-0以及s3hs5h双突变体背景下表型没有明显变化。在s3hs5h双突变体背景下超表达DLO2基因,其莲座叶直径与s3hs5h双突变体相比显著增大,SA含量较s3hs5h双突变体下降。(4)低SA拟南芥表型、代谢初步分析。获得35S-S3H和S5Hpro-S3H两类S3H超表达转基因植株,与野生型Col-0相比,它们的莲座叶直径均有明显增加,SA检测表明转基因植株游离SA和总SA含量均显著降低。与NahG转基因植物相比,35S-S3H转基因植株莲座叶直径无明显变化,个别株系游离SA和总SA含量略有下降;S5Hpro-S3H植株莲座叶直径均较NahG植物莲座叶直径显著增加,一些株系游离SA和总SA含量较NahG显著下降;在单拷贝植株中,S5Hpro-S3H莲座叶直径增加约10%,但游离SA和总SA含量较NahG植株下降不明显。(5)单拷贝低SA含量遗传学材料衰老表型分析。S5Hpro-S3H莲座叶出现明显晚衰表型,对其叶绿素含量以及Fv/Fm值进行测定,结果表明S5Hpro-S3H叶绿素含量和Fv/Fm高于Col-0,与NahG无明显差异,该结果与表型观察结果一致。(6)单拷贝低SA含量拟南芥超表达材料感病表型分析。NahG和S5Hpro-S3H感病性较Col-0更加严重,对感病后的孢子数进行统计,NahG与S5Hpro-S3H孢子数差异不明显,但均显著多于Col-0。此外,经病原菌Pst DC3000处理后,S5Hpro-S3H单拷贝转基因材料游离SA含量较NahG低约40-50%。综上所述,DLO2具有催化SA生成2,5-DHBA的能力,s5hdlo2双突变体具有明显的莲座叶变小表型,而s3hs5h背景下DLO2超表达材料莲座叶也有所恢复,说明DLO2具有一定生物学功能。此外利用植物内源基因S3H创制的低SA含量的遗传学材料是一种良好的SA研究遗传学材料,可用于SA相关领域研究。