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脂肪的过度沉积会造成畜产品品质下降,同时肥胖已经成为世界范围内重要的公共健康问题之一,是引起胰岛素抵抗、II型糖尿病和非酒精性脂肪肝等的主要因素。本研究通过网络药理学筛选,挖掘出潜在的调控脂肪沉积的化合物—dacinostat(达西司特)。随后采用腹腔注射方式处理高脂日粮饲喂小鼠并开展离体试验,从组织、细胞、分子水平研究了dacinostat对小鼠脂质代谢及能量稳态的影响。研究结果有助于明确dacinostat对调节小鼠能量稳态的作用,并将为动物脂肪沉积的调控以及肥胖相关疾病的治疗提供理论依据和研究思路。1.在小鼠原代脂肪细胞诱导培养基II中添加10 n M dacinostat,处理4-6天,观察细胞的成脂情况,检测成脂、脂解和线粒体代谢相关基因mRNA和蛋白表达水平等指标。结果显示,培养基中添加dacinostat极显著降低了小鼠原代白色脂肪细胞内的脂质沉积(P<0.01),显著降低了成脂相关基因Cebpb、Pparg、Cd36、Fabp4、Acc1、Fasn、Dgat2等的mRNA表达水平和C/EBPα、Pparγ、FAS等的蛋白表达水平(P<0.05),显著提高了ATGL和HSL的蛋白表达水平(P<0.05)。另一方面,dacinostat显著提高了棕脂标志基因Prdm16、Ppargc1a、Cox7a1、Ucp1和米色化相关基因Cd137、Tmem26、Tbx1的mRNA表达水平,显著提高了UCP1和PGC1α的蛋白表达水平(P<0.05)。而在小鼠原代棕色脂肪细胞中,也观察到培养基中添加dacinostat显著降低了细胞内的脂质沉积,显著降低了成脂相关基因Cebpb、Pparg、Cd36、Fasn、Dgat2等的mRNA表达水平,显著提高了ATGL和HSL的蛋白表达水平(P<0.05)。另一方面,dacinostat显著提高了棕脂标志基因Prdm16、Ppargc1a、Cox7a1、Ucp1的mRNA表达水平,显著提高了UCP1和PGC1α的蛋白表达水平(P<0.05)。研究表明,Dacinostat通过诱导小鼠原代白色脂肪细胞棕色化/米色化,激活小鼠原代棕色脂肪细胞产热,从而促进脂解,抑制成脂,最终减少脂肪细胞内的脂质积累。2.使用高脂日粮连续饲喂8周龄雄性C57BL/6J小鼠9周,其间分别隔日腹腔注射6.6%的DMSO,和溶于6.6%DMSO的dacinostat(1 mg/kg体重),检测试验小鼠生长生物学性状、葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性、血清生化指标、体温和冷耐受性等。结果表明,dacinostat能够在不影响采食量和肠道对甘油三酯吸收的前提下显著降低高脂日粮诱导的小鼠体重增加(P<0.05),显著改善小鼠的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性(P<0.05),极显著降低肝体比和肝脏的TG水平(P<0.01)。与此同时,dacinostat显著升高了小鼠肩胛部BAT和腹股沟WAT所在位置的体表温度(P<0.05),极显著增强了小鼠对冷刺激的耐受性(P<0.01)。研究表明,Dacinostat通过刺激机体产热,进而提高能量代谢水平,从而减缓高脂日粮引起的小鼠体重增加、改善葡萄糖耐受性与胰岛素敏感性,并且减少肝脏内脂质异位沉积。3.解剖提取小鼠的各部位白色脂肪组织(WAT)和肩胛部棕色脂肪组织(BAT),观察其形态并称重,检测其线粒体DNA含量、线粒体相关基因mRNA和蛋白表达水平并进行ChIP-qPCR分析。结果显示,dacinostat能够显著降低各部位脂肪组织占体重的比例(P<0.05),而不影响心、脾、肺、肾等主要器官和腓肠肌(Gas)、胫骨前肌(TA)等主要肌肉的重量。同时,dacinostat使得e WAT内截面积小于3000μm~2的脂肪细胞数目显著增加(P<0.05),截面积大于5000μm~2的脂肪细胞数目极显著减少(P<0.01);使得iWAT内截面积1000-3000μm~2大小的脂肪细胞数目极显著增加(P<0.01),而截面积大于7000μm~2的脂肪细胞数目极显著降低(P<0.01)。与此同时,dacinostat极显著升高了BAT和iWAT内的mt DNA/g DNA比例(P<0.01),显著提高了BAT和iWAT内线粒体相关基因Ucp1、Ppargc1a、Cidea、Cox7a1、Cpt1b的mRNA表达水平和UCP1、PGC1α的蛋白表达水平(P<0.05)。而且,dacinostat还显著提高了BAT和iWAT内蛋白的乙酰化水平,尤其是H3K27的乙酰化水平(P<0.05)。ChIP-qPCR试验显示,dacinostat极显著地提高了棕色和白色脂肪细胞内UCP1转录起始位点、UCP1增强子和Pgc-1α启动子上MEF或cAMP响应元件(CRE)区域H3K27ac的富集程度(P<0.01)。研究表明,Dacinostat通过诱导UCP1转录起始位点、UCP1增强子和Pgc-1α启动子上MEF或cAMP响应元件(CRE)区域H3K27的乙酰化增加,促进Ucp1和Pgc-1α转录激活,进而激活棕色脂肪产热和白色脂肪棕色化,最终降低脂肪组织内的脂质沉积。综上,dacinostat通过诱导UCP1转录起始位点、UCP1增强子和Pgc-1α启动子上MEF或cAMP响应元件(CRE)区域H3K27的乙酰化增加,促进Ucp1和Pgc-1α转录激活,进而激活棕色脂肪产热和白色脂肪棕色化,提高小鼠的能量代谢水平,最终帮助小鼠抵抗高脂日粮诱导的肥胖。