背景与目的：新生血管在肿瘤生长、侵袭和转移过程中起着重要作用,随着对肿瘤血管生成分子机制认识的逐渐深入,以肿瘤血管异质性为基础的血管功能性分子标记物不断开发,使以肿瘤新生血管为靶点的肿瘤分子成像成为可能。现有的超声造影剂粒径多在1-8um左右,诊断条件下难以透过血管壁的细胞间隙进入组织间质,是真正意义上的血池造影剂,与其它在分子水平用于评价肿瘤血管生成的影像学方法如CT、MRI, PET等比较,无造影剂外渗致背景信号增高的缺陷,造影增强信号完全来自于肿瘤血管床,同时超声技术具有较好的空间分辨率和实时显像功能,操作简便,无辐射损伤,更适合用于肿瘤血管生成的研究。研究表明,在实体瘤发生的早期阶段已有血管生成开关的启动。KDR作为最重要的血管生长因子VEGF的主要受体,介导VEGF的内皮细胞增殖、迁移、血管通透性增加等促血管生成活性,在肿瘤血管生成过程尤其是早期阶段起着关键作用。本课题组前期的研究证实从人正常乳腺-单纯增生-非典型增生-乳腺原位癌-乳腺浸润性癌这一发生与演进过程中,KDR表达逐渐增高增强,尤其在乳腺原位癌及乳腺浸润性癌的血管内皮细胞呈持续高表达,表明以KDR为靶点进行乳腺癌新生血管分子显像可能为乳腺癌的早期诊断提供新的思路。KDR高表达于乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤新生血管内皮细胞,与肿瘤的发生与转移密切相关,提示KDR可能成为多种实体瘤新生血管特异性分子显像的靶标并用于评价肿瘤血管生成状态,估测预后及进一步用于抗血管生成治疗疗效监测。靶向超声分子显像在血栓、炎症、动脉粥样硬化以及肿瘤新生血管的评价方面已取得初步成果。目前与超声微泡连接用于超声分子显像的配体主要以抗体居多,抗体与靶细胞表面抗原结合特异性强,但抗体明显的免疫原性,分子量过大,受其表面修饰位点限制显像灵敏度不够高的缺陷限制了以抗体为导向分子的靶向造影剂在体内应用。因此,本实验中我们选择分子量小,与靶点结合特异性强的短肽作为与超声造影剂结合的配体,将从噬菌体肽库中筛选到的与KDR有高亲和活性的12肽K237通过生物素-亲和素桥与脂质体微泡偶连,构建靶向微泡,体外实验鉴定其生物活性,同时建立裸鼠移植瘤模型进行超声造影显像,探讨以KDR为靶点进行乳腺癌新生血管分子靶向超声显像的可行性。材料与方法：1.短肽的合成参照文献方法固相合成与KDR有高亲和活性的氨基酸序列为(HTMYYHHYQHHL)的生物素化十二肽以及含随机序列的对照肽,高效液相色谱法测定化学纯度,柱层析法进行纯化分离,收集主峰进行质谱分析。2.DiI红色荧光标记的靶向微泡的制备按摩尔比称取一定量的DSPC、DPPE-Biot于三颈瓶中,并加入DiI染料、PEG4000、泊洛沙姆(F188),加25ml蒸馏水,于70℃水浴搅拌30min,放冷至室温。把制好的脂质混悬液加入50ml聚丙烯管内,将剪切刀头插至液面下,通入全氟丙烷2min气体,以一定的剪切速度剪切一定时间,制得包裹全氟丙烷气体的脂质微泡,分装于西林瓶中充入全氟丙烷气体密闭,制备得到生物素化DiI红色荧光标记的脂质微泡。生物素化脂质微泡加入链亲和素,冰上孵育30min,纯化洗涤后再分别加入生物素化12肽或含随机序列的对照肽,冰上孵育30min,洗涤纯化后即制备出靶向微泡(MBp)和对照微泡(MBc),4℃冰箱保存。3.靶向微泡理化性质鉴定同上述步骤制备生物素化的DiI红色荧光标记的普通微泡,加入链亲和素,洗涤纯化后加入FITC标记的生物素化12肽,冰上孵育30min,洗涤纯化后即制备出FITC标记的靶向微泡(FITC-MBp).库尔特计数仪进行粒度分析,光镜及荧光显微镜观察微泡形态、荧光分布,荧光显微镜下观察FITC绿色荧光标记的小肽与DiI红色荧光标记的微泡的连接情况。4.靶向微泡体外靶向试验4.1.体外靶向试验：细胞免疫荧光及Western Blot检测人结肠癌癌LOVO细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人结肠癌LS174T细胞KDR表达情况,DiI标记的靶向微泡(MBp)及DiI标记的对照微泡(MBc)分别与三种细胞孵育30min, DAPI染核后,普通光镜及荧光显微镜下观察微泡与三种细胞的粘附情况,取10个随机视野,计数每个视野内平均每个细胞周围粘附的微泡数量,比较三种细胞周围粘附的微泡数量的差异。4.2.阻断试验：将一定量的K237与LOVO细胞孵育30min后滴加DiI标记的靶向微泡(MBp), DAPI染核后,普通光镜及荧光显微镜下观察微泡与LOVO细胞的粘附情况,取10个随机视野,计数每个视野内平均每个细胞周围粘附的微泡数量,并与未封闭组比较有无差异。4.3.统计学分析：采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析,所有数据均以x±s表示。三种细胞与靶向微泡之间的粘附情况选用近似F检验Welch法进行方差分析；组间多重比较采用DunnetT3检验。LOVO细胞靶向微泡与对照微泡之间采用两独立样本t检验；LOVO细胞靶向组与阻断组微泡粘附数量比较采用两独立样本t检验。5.动物模型的建立收集处于对数生长期的MDA-MB-231细胞、LS174T细胞(培养于含10%血清的1640培养基,37℃、5%C02孵箱培养)制成浓度为5.0x107/ml的细胞悬液。6-8周龄雌性裸鼠36只,随机选取18只注射MDA-MB-231细胞,余注射LS174T细胞。每鼠无菌条件下局部消毒,于裸鼠皮下第三对乳腺脂肪垫处缓慢注射0.1ml的细胞悬液,见局部形成隆丘后退针,定期观察肿瘤生长情况。6.动物体内超声造影成像及对比图像分析6.1.实验分组：36只移植瘤模型裸鼠分为两组,MDA-MB-231、LS174T移植瘤模型各18只；两组移植瘤模型裸鼠各组随机选12只移植瘤模型行靶向微泡超声造影检查,各组余6只小肽预先封闭后再行靶向微泡超声造影检查。6.2.靶向超声造影实验：取MDA-MB-231、LS174T移植瘤裸鼠各12只,10天后行MBp和MBc超声造影检查。麻醉后裸鼠仰卧位固定于自制平台上。将探头放于支架上并调整探头使肿瘤能够良好显像。CEU检查选用采用二次谐波成像(second harmonic imaging)技术进行,探头发射频率为10.0MHz,接收频率为14MHz机械指数(Mechanical Index, MI)为0.14,实验过程中各项参数及探头位置保持不变。所有裸鼠经尾静脉分别随机注射0.2ml浓度为2.0×108/ml的靶向微泡、对照微泡(时间间隔为30min)。注入微泡5min后获取肿瘤声学造影第一帧图像,此后,以高MI(1.9)连续超声发射2-3s破坏微泡后,继续存储图像3-4帧。全部声学造影图像存于DVD盘,以备脱机分析。6.3.小肽阻断试验：两组瘤鼠各6只,以0.2mlK237小肽预先注射30min后再注射2.0×108/ml靶向微泡0.2ml,造影方法及图像处理同前。6.4.图像分析：应用MCE软件对超声图像进行分析,测量实验裸鼠肿瘤显影各个图像的声强度(video intensity, VI),其中第一帧图像的声强度值代表微泡在组织及循环中的总浓度,包括肿瘤组织的粘附和体内血液循环的微泡,高机械指数超声波破坏后的声强度值为血液循环中的微泡浓度,前者减去后者即得到粘附在肿瘤组织中的微泡浓度。采用彩色编码技术制作肿瘤组织及周边组织彩色编码图像。6.5.统计学分析：采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析,所有数据均以x±s表示。肿瘤组织内靶向微泡、对照组微泡、阻断组VI值比较均采用One-Way ANOVA,方差不齐则选用近似F检验Welch法进行方差分析；组间多重比较方差齐性采用LSD检验,方差不齐采用DunnetT3检验。7.动物活体荧光成像所有裸鼠行超声造影后次日进行活体荧光成像。裸鼠以4%的戊巴比妥钠0.2ml腹腔麻醉。麻醉后裸鼠仰卧位固定于自制平台上,随机选取24只(两组肿瘤各12只)分别经尾静脉注入DiI荧光标记的靶向微泡MBp、对照微泡MBc,余裸鼠则以K237小肽封闭30min后再注射DiI荧光标记的靶向微泡Mβp,微泡剂量、浓度及时间间隔同超声造影。注入微泡后,采用KODAK Image Station4000MM Digital系统,采用549nm的激发光,发射波长为564nm,观察各组微泡在肿瘤部位的粘附情况。8.肿瘤组织免疫组化分析处死裸鼠,取出裸鼠肿瘤组织及瘤周正常组织,4%多聚甲醛固定,行免疫组化检查,检测组织内KDR表达情况。结果：1.高效液相色谱及质谱分析：合成肽高效液相色谱分析主峰测定值为2522.9D,与理论分子量2523.6D基本符合,主峰含量约98.5%,合成成功。2.超声微泡理化性质：制备得到的靶向脂质体微泡(MBp)和对照微泡(MBc)普通光镜下观察分布均匀,无聚集现象,单个微泡外观圆整。库尔特计数仪测得MBp浓度约为(5.17±1.0)x108个/ml,粒径为(2.01±0.93)μm, MBc浓度约为(5.37±1.07)x108个/ml,粒径为(2.10±1.03)μm。荧光显微镜下见FITC标记的靶向微泡(FITC-MBp)外壳发出明亮的黄色荧光,表明荧光标记的小肽与DiI标记的微泡外壳连接良好。3.靶向微泡体外性能鉴定3.1.结合试验：细胞免疫荧光及Western Blot结果显示,LOVO细胞呈KDR强阳性表达,MDA-MB-231细胞呈KDR阳性表达,LS174T细胞呈KDR阴性表达。光镜下见LOVO细胞周围较多靶向微泡粘附,荧光显微镜下LOVO细胞核发出明亮的蓝色荧光,细胞周围见较多红色荧光的靶向微泡粘附；光镜下MDA-MB-231细胞周围见部分靶向微泡粘附,荧光显微镜下MDA-MB-231细胞核发出明亮的蓝色荧光,细胞周围可见部分红色靶向微泡粘附；LS174T细胞周围未见明显红色靶向微泡粘附；对照微泡在三组细胞粘附量极少,未见明显红色微泡粘附。3.2.阻断试验：普通光镜下,预先以K237小肽封闭的LOVO细胞周围靶向微泡粘附数量较未封闭组明显减少,荧光显微镜下见LOVO细胞周围红色荧光强度明显减弱。3.3.统计学分析：三种细胞粘附靶向微泡数量之间比较有显著性差异(P=0.000); LOVO细胞周围粘附的MBp数目高于MDA-MB-231(19.12±2.83、9.64±2.67, P=0.000); LOVO细胞周围粘附的MBp数目明显高于LS174T细胞周围粘附的MBp(19.12±2.83、0.30±0.23, P=0.000); LOVO细胞周围粘附的MBp明显高于MBc (19.12±2.83、0.16±0.15, P=0.000)。小肽预先封闭后,LOVO周围细胞靶向微泡粘附数量与未封闭组靶向微泡的粘附数量有统计学差异(3.22+2.24、19.12+2.83,P=0.000)。4.动物体内实验4.1.动物模型制备：10天后,36只裸鼠均于注射部位形成肉眼可见的实体瘤,瘤体直径0.4-0.8cm,平均直径0.6cm,肿块边缘不规则,表皮完好,无破溃出血。4.2.超声造影及图像分析：超声造影彩色编码显示,MDA-MB-231肿瘤组,MBp在肿瘤组织内部的彩色编码图像显示肿瘤组织超声显影显著不均匀增强,而MBc在肿瘤组织彩色编码图像见轻度超声显影,K237小肽封闭后MBp在肿瘤组织彩色编码图像见轻度超声显影；LS174T组,MBp在肿瘤组织内部的彩色编码图像显示肿瘤组织超声显影显著不均匀增强,而MBc在肿瘤组织彩色编码图像见轻度超声显影,K237小肽封闭后MBp在肿瘤组织彩色编码图像见轻度超声显影。4.3.统计学分析：MDA-MB-231肿瘤组,靶向微泡组在肿瘤组织的VI值与对照微泡在肿瘤组织的VI值比较有显著性差异(38.11±11.75、12.52±5.23,P=0.000),靶向微泡组声强度值约为对照微泡组3倍；K237预先封闭组声强度值与未封闭组相比有显著性差异(13.77±4.35、38.11±11.75,P=0.000)。LS174T肿瘤组,靶向微泡组VI值与对照微泡V1值比较有显著性差异(30.18±9.56、8.28±4.74,P=0.000),靶向微泡组约为对照组的3.6倍,K237预先封闭组声强度值与未封闭组有显著差异(9.23±3.44、30.18±9.56,P=0.000)5.动物体内活体荧光成像：两组荷瘤裸鼠注射荧光标记的MBp后6-10分钟可在肿瘤部位显示局部明亮的红色荧光,注射荧光标记的对照微泡及小肽K237预先注射封闭30min后再注射荧光标记的靶向微泡,两种肿瘤部位均未见局部红色荧光出现。6.免疫组化：免疫组化检查显示,MDA-MB-231肿瘤组织内部见较多量新生血管,血管内皮细胞棕色着色,KDR阳性表达,LS174T肿瘤组织边缘见新生血管内皮细胞棕色着色,KDR阳性表达。结论：1.制备得到的以KDR为靶点的靶向微泡在体外具有与靶细胞结合的高度特异性。2肿瘤靶向显像效果是通过小肽与肿瘤组织内新生血管内皮特异性地结合而促使靶向微泡粘附于肿瘤血管床实现的。3.针对肿瘤新生血管内皮细胞的靶分子可能适用于不同类型实体瘤,这种分子成像可能在肿瘤早期诊断、预后评价、抗肿瘤血管生成治疗及疗效监测方面具有应用前景。