[背景]脑卒中,又称脑中风或脑血管意外,是由脑部血液循环障碍导致大脑功能缺失为特征的一组疾病,在全世界是第三大致死病因,而在我国已经成为第一大致死病因。然而,目前针对单个或多个脑血管危险因素诱发脑卒中的遗传和分子“决定因素”知之甚少。同时,脑卒中发展过程中皮层神经细胞以多种形式死亡,包括坏死、凋亡和自噬,这一复杂的细胞死亡分子信号通路仍不清楚。综合过去30年来的研究,脑卒中细胞死亡的主要分子机理包括：兴奋性神经毒性、钙超载和氧/氮化应激。缺血缺氧时,谷氨酸过量聚集于突触,激活突触后谷氨酸受体包括NMDA和AMPA受体,特别是NMDA受体起着至关重要的作用,大量Ca2+通过NMDA受体通道流入细胞内,导致Ca2+超载,并激活一系列蛋白酶、酯酶和核酶的降解过程从而引发下游致命反应,包括活性氧的产生,活性氮的产生,离子体内失衡,线粒体功能紊乱等,最终细胞因为凋亡(DNA断裂和染色质凝结)或坏死(肿胀、破裂和细胞溶解)或者两者的共同作用而死亡。缺血性卒中目前唯一有效的治疗是运用组织纤溶酶原激活物(tPA)进行溶栓治疗。然而,由于tPA的治疗存在严格的治疗指征、有出血副作用和溶栓治疗时问窗较窄(<4.5小时),只有很少的患者能从中受益。因此,探讨新的干预方法和治疗手段保护神经细胞来对抗缺血性卒中脑损伤极其重要。死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)是一个编码160KD蛋白的钙离子/钙调蛋白依赖的丝氨酸-苏氨酸激酶,我们的前期结果显示,DAPK1与NMDA受体NR2B羧基末端(NR2B-CT)介导NMDA受体兴奋性毒性作用。此外DAPK1还通过其死亡结构域(Death Domain, DD)与p53的DNA结合域(p53DNA binding motif, p53DM)直接耦合汇聚卒中多条细胞死亡通路。但是直接干预DAPK1死亡信号能否更安全有效地治疗缺血性脑卒中仍需进一步研究加以验证。本研究将在前期工作基础上,以谷氨酸受体偶联的特异性细胞死亡相关蛋白DAPK1及其作用的信号分子NR2B, p53为切入点,通过运用分子遗传手段或应用外源性小分子多肽干预DAPK1死亡信号,在细胞水平与动物整体水平进一步探讨脑卒中治疗的有效策略。[目的]本研究的目的是运用分子遗传手段选择性敲除兴奋性神经元中NR2B-CT,干预DAPK1-NR2B死亡信号,或应用外源性小分子多肽Tat-p53DM阻断DAPK1-p53死亡信号,探讨脑卒中治疗的有效策略。[方法]为了验证NMDA受体亚单位NR2B-CT介导DAPK1死亡信号参与调控缺血性卒中脑损伤,我们首先将本实验室自主构建的条件诱导性敲除NMDA受体NR2B-CT的点突变小鼠与在兴奋性神经元中表达Cre重组酶的Camk2a-CreERT2转基因小鼠杂交,双杂后代通过他莫西芬(TAM)诱导获得在兴奋性神经元中特异性敲除NR2B-CT的突变小鼠(012362×NR2B-CT).通过PCR和尼式染色鉴定转基因小鼠基因型和脑组织结构表型。然后通过免疫组织化学(IHC)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)验证突变小鼠NR2B-CT在兴奋性神经元中的敲除。随后,通过体外实验OGD或氧化应激后PI染色检测突变小鼠皮层神经元的凋亡情况。同时通过免疫共沉淀实验(Co-IP)检测大脑中动脉栓塞(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)术后皮层组织NR2B与DAPK1相互作用。TTC染色,核磁共振成像(MRI), Fluoro-Jade C (FJ)染色检测缺血后脑梗塞体积及死亡的神经细胞数量。最后通过行为学转棒实验,生存率统计检测MCAO术后一个月内小鼠运动协调能力恢复情况。通过高架十字迷宫(Elevated Plus Maze)、水迷宫(Morris Water Maze)、条件恐惧实验(Fear Conditioning)检测成年突变小鼠焦虑情况,空间学习记忆及恐惧记忆能力。同时,基于前期离体细胞研究结果,为了探讨更为安全有效的缺血性卒中治疗方法,我们运用在体小鼠MCAO缺血模型,通过合成小分子穿膜肽Tat-p53DM阻断缺血脑区DAPK1-p53死亡信号,利用Co-IP与Western blotting检测术后不同剂量的Tat-p53DM以及不同治疗时间窗对DAPK1-p53相互作用的抑制效果,并通过TTC染色和FJ染色检测术后脑梗塞的体积和死亡的神经细胞数量。然后应用修订后的神经系统评分系统(7分制),转棒实验,足误实验(Foot Fault Test)检测术后一个月内小鼠经多肽治疗后神经功能恢复情况和运动协调能力。最后通过旷场实验(OpenField)、高架十字迷宫、水迷宫实验检测小鼠自主运动行为,探索行为,焦虑情况及空间学习记忆能力。[结果]我们发现在兴奋性神经元中特异性敲除NR2B-CT (012362×NR2B-CT)降低了MCAO术后皮层内DAPK1与NR2B的结合。体外OGD实验结果显示012362XNR2B-CT小鼠原代培养的神经元PI染色阳性(PI+)细胞数目约为对照组的40%-50%,pMLC(反映DAPK1活性),cleaved caspase3表达水平约为对照组的70%,在应用H202分别刺激1小时,2小时,3小时后,012362×NR2B-CT小鼠pI+分别为对照组的88%,40%,36%,说明体外模拟缺血时,012362×NR2B-CT小鼠神经元死亡比率明显降低。与OGD及氧化应激结果类似,在体模拟缺血的MCAO模型中012362×NR2B-CT小鼠成功干预了DAPK1与NR2B的结合,较野生型小鼠也显示更少的神经元死亡。TTC染色,MRI,FJ染色结果显示012362×NR2B-CT小鼠脑梗塞体积和脑水肿体积明显减小,皮层和纹状体死亡的神经细胞数目显著减少。而且在术后一个月,012362×NR2B-CT小鼠存活率较对照组显著提高,在转棒上的停留时间较对照组显著增加。四周时,012362XNR2B-CT突变小鼠肢体协调能力基本恢复到术前的90%。因此在兴奋性神经元中敲除的NR2B-CT干预了DAPK1-NR2B死亡信号,可有效治疗卒中。但是值得注意的是,Morris水迷宫结果显示,在“定位航行试验”中,012362X NR2B-CT从第4天开始潜伏期显著高于对照组,在“空间探索试验”中012362ＸNR2B-CT小鼠显示更长的潜伏期和较少的穿越平台次数。这一结果提示012362×NR2B-CT小鼠空间学习记忆能力降低。条件性恐惧实验结果显示在检测场景恐惧记忆时,012362×NR2B-CT小鼠僵直反应次数也明显降低,表明其海马依赖的恐惧记忆能力降低。以上结果提示通过分子遗传手段敲除与DAPK1结合的NR2B羧基末端片段干预DAPK1-NR2B死亡信号治疗缺血性卒中有一定的局限性,因此,基于近期研究工作,我们将目光转向DAPK1-p53死亡信号。我们发现利用合成的小分子穿膜肽Tat-p53DM (1mg/kg)可阻断小鼠脑组织DAPK1-p5380%的结合。TTC染色,FJ染色结果显示,MCAO术后6小时注射1mg/kg的Tat-p53DM显著降低了脑梗死的体积,其中Tat-s-p53DM对照组脑梗死体积为31.9±5.8mm3,而Tat-p53DM实验组为18.6±3.7mm3。同时Tat-p53DM大幅度地减少了在最易受损伤的大脑区域包括纹状体和海马区死亡的神经细胞数量。当成年雄性小鼠卒中发作后6小时注射Tat-p53DM,在注射Tat-s-p53DM组,FJ+约为220±10/mm3,而在Tat-p53DM实验组,FJ+约为95±8/mmm3,说明该多肽对大脑损伤有显著治疗效果。行为学的结果显示Tat-p53DM治疗后24小时到4周的一个月观察期显示比对照多肽Tat-s-p53DM更好的神经功能评分和完全恢复的运动协调能力。而且我们发现在旷场实验中注射Tat-p53DM不影响小鼠的运动能力,自主行为和探索行为。高架实验显示注射Tat-p53DM不会引起焦虑行为。Morris水迷宫结果显示注射Tat-p53DM组与对照组空间学习记忆能力无明显差别。因此上述结果提示,Tat-p53DM可以有效治疗卒中且不影响正常生理功能。[结论]本研究首先聚焦DAPK1-NR2B死亡信号,发现在兴奋性神经元中特异性敲除NR2B-CT可以干预DAPK1-NR2B相互作用有效治疗卒中,但是同时影响了学习记忆功能。而利用小分子穿膜肽Tat-p53DM则可以有效阻断DAPK1与p53的结合,通过抑制DAPK1-p53死亡信号有效保护缺血脑损伤,且不影响正常生理功能,因此干预DAPK1-p53死亡信号可能是卒中治疗的首选策略。