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开发高效低毒的基因转染载体是基因治疗领域中的关键技术问题。近年来,凭借其独特的理化性质,功能化石墨烯在生物医学领域引起了人们的广泛关注,显示出良好的应用前景。我们的前期研究发现,与传统的转染试剂相比,聚乙二醇与聚乙烯亚胺共同修饰的氧化石墨烯(nGO-PEG-PEI)对质粒DNA和siRNA的转染效率更加理想,然而在高浓度下仍表现出一定的细胞毒性。因此,本课题将系统研究并揭示其细胞毒性机理,以便将其进一步优化,并为开发出理想的基因转染载体提供重要的理论依据。我们首先对nGO-PEG-PEI的细胞毒性进行了研究。MTT实验结果显示,10μ/mL左右的nGO-PEG-PEI处理可造成多种细胞活性降低。Annexin V-FITC/PI双染实验表明该材料的细胞毒性是通过细胞坏死途径产生,而非细胞凋亡途径。通过比较MTT实验与Annexin V-FITC/PI双染实验的结果,发现两种实验方法的结果存在一定差异,结合其实验原理,分析得出nGO-PEG-PEI可能影响了细胞周期。后续一系列研究表明, nGO-PEG-PEI引起HeLa细胞的S期细胞阻滞现象,且绝大部分死亡细胞处于S期：这些细胞因为不能顺利完成由S期向G2期的转变,导致细胞坏死。将细胞同步化在G1期后再经nGO-PEG-PEI处理,发现,nGO-PEG-PEI处理组的细胞整个细胞周期变长,且进入S期时有显著的延迟。随后,我们对nGO-PEG-PEI引发S期细胞阻滞的分子机理进行了深入研究。实验表明,nGO-PEG-PEI引起了严重的DNA损伤,而且引发S期检验点活化所必需的Cdc25A高度磷酸化。免疫印迹的结果表明,nGO-PEG-PEI处理后的细胞中,Cdc25A活化通路中的相关蛋白质,包括ATM/ATR及其它们对应的底物Chk2和Chk1,其磷酸化水平均显著提高。此外,nGO-PEG-PEI引发的S期细胞阻滞及细胞形态的改变可被Cdc25A磷酸化抑制剂AZD7762所抑制。由以上结果分析可知,nGO-PEG-PEI进入细胞后,通过某种未知途径引起DNA损伤,而DNA损伤通过ATM-Chk2及ATR-Chk1两条信号通路激活Cdc25A,从而激活S期检验点,最终引起S期细胞阻滞和细胞周期的延长,严重时,造成细胞坏死。本研究揭示了nGO-PEG-PEI介导的真核细胞坏死的分子机制,为深入探索GO及其衍生物的细胞学效应,尤其是其对真核细胞的细胞周期的影响方面,提供了重要的理论依据,同时也为GO及其衍生物的改性以成为高效无毒的基因转染载体提供了重要信息,在纳米材料的生物学效应及生物医学应用研究等方面有重大理论与实践意义。