研究背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是1型和2型糖尿病的一个重要和常见的并发症,虽然目前有多项医疗措施可延缓疾病进展,但是仍约三分之一的糖尿病患者发展为终末期肾脏疾病,需要行肾脏替代治疗。因此,探索糖尿病肾病中促进肾小球损伤的机制,以期获得新的治疗策略,是目前医学研究的一个热点。肾小球的滤过屏障由毛细血管内皮细胞(endothelial cell)、肾小球基底膜(Glomerular basement memberane, GBM)以及足细胞(Podocyte)组成。肾小球足细胞是一种终末分化的细胞,它驻留在肾小球基底膜的外表面上,并在维持肾小球滤过屏障的结构和功能中发挥关键作用。越来越多的证据表明,肾小球足细胞在糖尿病肾病的发病机制中发挥了举足轻重的作用。一些研究表明,在1型和2型糖尿病中,足细胞的损伤和减少是DN发病机制中最早的机制之一。高葡萄糖(HG)在体外或体内均可诱导足细胞凋亡,导致足细胞损伤和数目的减少。文献报道,高血糖或者氧化应激产物(ROS)增加可能是糖尿病肾病中足细胞损伤和凋亡的触发因素。然而,高血糖诱导足细胞凋亡的具体机制尚未被完全阐明。因此,目前也尚无理想的干预措施来防治DN患者的足细胞凋亡。活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)是一类Ca2+/钙调磷酸酶(calcineurin, CaN)依赖的转录因子,包括NFAT1、NFAT2、NFAT3、 NFAT4及NFAT5共5个亚型。人们最初发现NFAT的表达在免疫细胞的免疫应答中对细胞因子的基因和其他基因的转录发挥举足轻重的作用；随后发现它们也存在于机体的非免疫细胞中并发挥重要的生物学功能。NFAT不仅在调节多种细胞的生长、增殖生理过程中发挥至关重要的作用：例如调节心脏瓣膜的发育、骨骼肌和平滑肌细胞的分化以及血管的发育。同时,NFAT的过度活化也可导致心肌及骨骼肌细胞的病理性肥大。NFAT的活化高度依赖于Ca2+/CaN,而环孢素A (cyclosporine A, CSA)可以有效地抑制CaN。正常情况下,NFAT以高度磷酸化的形式存在于胞质中,当细胞受到某种刺激导致钙离子内流增加时,通过激活钙调磷酸酶,随之引起NFATc去磷酸化并转移入核,NFAT的蛋白单独或与其他核伙伴组合形成NFATc转录络合物来控制靶基因的转录,从而发挥相应的生理或病理作用。近期相关文献报道：高葡萄糖可激活血管平滑肌细胞、胰腺β细胞的NFAT。也有文献报道：NFAT的过度活化可导致几种类型细胞的凋亡。同时,最近有研究还表明,NFAT的过度活化参与了足细胞损伤和肾小球硬化,但是目前未见关于高血糖是否可激活肾小球足细胞的NFAT2并进而导致足细胞凋亡的报道。本研究旨在探讨高葡萄糖是否能活化体外培养足细胞的NFAT2和活化的NFAT2在高葡萄糖诱导的足细胞凋亡中所发挥的作用；同时观察NFAT2活化是否对足细胞中的促凋亡因子Bax的表达产生影响并由此促进细胞的凋亡；最后观察高葡萄糖对足细胞Ca2+内流的影响情况。初步探讨DN肾小球足细胞损伤的机制。研究方法一、足细胞培养、鉴定及实验分组(一)足细胞培养：条件永生性小鼠足细胞由Baylor医学院Danesh教授惠赠。首先在5%C02,33℃培养箱环境,用含20-100U·mL-1IFN-γ的RPMI1640和10%FBS放入Ⅰ型胶原包被的培养瓶中共孵育,使其获得增殖能力。然后转入5%CO2,37℃培养箱,用不含IFN-y的DMEM加5%FBS共孵育,经10-14天的培养诱导,足细胞进入分化阶段并最终分化成熟。(二)足细胞鉴定及形态学观察：分别对33℃含IFN-y培养及37℃不含IFN-y培养10-14天分化成熟后的足细胞在相差显微镜下直接拍片,观察其形态学差异；表达足细胞骨架蛋白synaptopodin的细胞为分化成熟的足细胞,未分化的足细胞不表达synaptopodin蛋白。(三)按以下不同目的进行分组干预处理足细胞：1、不同糖浓度干预下足细胞核中NFAT2的表达情况1)正常糖组予Glucose5.3mM干预2h；2)高糖组分别予Glucose10mM、Glucose20mM、Glucose30mM和Glucose40mM干预2h。2、不同作用时间下足细胞核中NFAT2的表达情况1) Glucose5.3mM分别作用0.5h、1h、2h和4h；2) Glucose20mM分别作用0.5h、1h、2h和4h。3、不同干预下足细胞核中NFAT2的表达情况1) Glucose5.3mM作用2h；2) Glucose20m M作用2h；3) Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用2h；4) Glucose20mM+11R-vivit100nM作用2h；5) Glucose20mM+CsA500nM作用2h；6) Glucose20mM+体积0.1%DMSO作用2h；7) Glucose5.3mM+Ionomycin500nM作用2h。4、不同干预下足细胞的凋亡1) Glucose5.3mM作用12h；2) Glucose5.3mM作用24h；3) Glucose5.3mM作用48h；4) Glucose20mM作用12h；5) Glucose20mM作用24h；6) Glucose20mM作用48h；7) Glucose20mM+11R-vivit100nM作用48h；8) Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用48h。5、不同干预下足细胞的促凋亡因子Bax的表达情况1) Glucose5.3mM作用24h；2) Glucose20mM作用24h；3) Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用24h；4) Glucose20mM+11R-vivit100nM作用24h；5) Glucose5.3mM作用48h；6) Glucose20mM作用48h；7) Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用48h；8) Glucose20mM+11R-vivit100nM作用48h。6、不同干预下足细胞Ca2+内流的变化情况1) Glucose5.3mM作用5min；2) Glucose20mM作用5min;3) Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用5mmin；4) Glucose5.3mM+Ionomycin500nM作用5min。二、NFAT2的活化、足细胞凋亡、Bax的表达和Ca2+内流的情况分别用免疫荧光、Western blot检测NFAT2的活化；流式细胞术检测足细胞的凋亡；实时定量PCR和Western blot检测Bax表达；采用荧光染料法,用激光共聚焦动态观察足细胞内Ca2+水平的变化。三、统计学处理：计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,结果用单因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齐性用LSD法进行组间多重比较,方差不齐用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。P<0.05被定为有统计学差异。结果一、葡萄糖呈浓度依赖活化NFAT2Glucose5.3mM、Glucose10mM、Glucose20mM、Glucose30mM及Glucose40mM各自作用足细胞2h, Western blot检测结果显示足细胞核中NFAT2/Histone3的比值分别为0.999±0.001;1.652±0.188;2.405±0.281;1.850±0.397及2.000±0.381。高糖系列组与Glucose5.3mM组比较,足细胞胞核中的NFAT2均有增加,其差异具有统计学意义(P5.3mM组.10mM组=0.020；P5.3mM组，20mM组<0.001；P5.3mM组,30mM组=0.005；P5.3mM组,40mM组=0.002)；在相同培养时间时,葡萄糖对足细胞NFAT2表达的影响呈浓度依赖；当应用葡萄糖浓度为20mM的培养基培养2h时,NFAT2的活化达到高峰。二、高浓度葡萄糖呈时间依赖活化NFAT2Glucose5.3mM (NG)分别作用足细胞0.5h、1h、2h和4h, western blot显示NFAT2/Histone3结果分别为：1.000±0.000；1.080±0.321、1.229±0.385及1.112±0.458；各组两两对比,其差异均无统计学意义(P NG0.5h组,NG1h组=0.792；P NG0.5h组,NG2h组=0.455；P NG0.5h组,NG4h组=0.713；P NG1h组,NG2h组=0.626；P NG1h组,NG4h组=0.916；及P NG2h组,NG4h组=0.701)；Glucose20mM (HG)分别作用足细胞0.5h、1h、2h和4h,western blot显示NFAT2/Histone3结果分别为：1.253±0.332、1.656±0.464、2.080±0.319及1.601±0.431；其中HG0.5h组与HG1h组对比,其差异不具有统计学意义(PHG0.5h组,HG1h组=0.197),HG0.5h组与HG2h组对比,其差异具有统计学意义(P HG0.5h组,HG2h组=0.014),HG2h组与HG4h组对比,其差异不具有统计学意义(P HG2h组,HG4h组=0.128)。由此推测：在高浓度葡萄糖的培养基中,足细胞NFAT2表达的呈时间依赖；当应用葡萄糖浓度为20mM的培养基培养2h时,NFAT2的活化达到高峰。三、不同干预下NFAT2的活化情况及荧光表达情况Western blot检测显示足细胞核中NFAT2/Histone3的比值：Glucose20mM2h(HG)组为2.039±0.373；与Glucose5.3mM+Ionomycin500nM2h组(2.353±0.506)结果相近,两组差异不具有统计学意义(P HG组. Ionomycin组=0.220); Glucose20mM+11R-vivit100nM2h组与Glucose20mM+CsA500nM2h组分别为：1.223±0.188、1.208±0.207,比Glucose20mM2h组明显减少,其差异具有统计学意义(P11R-vivit组,HG组=0.005；PCsA组,HG组=0.004),与Glucose5.3mM2h(NG)组(1.000±0.000)相近,其差异不具有统计学意义(P11R-vivit组,NG组=0.378；P CsA组,NG组=0.409)；Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM(渗透压对照)组为：1.173±0.194,与Glucose5.3mM2h组相近,其差异不具有统计学意义(P渗透压对照组,NG组=0.491)。由此推测：高浓度葡萄糖通过不依赖增加渗透压的途径活化足细胞的NFAT2,使用CsA抑制CaN或者11R-vivit均可明显减少高糖诱导的NFAT2的活化。应用激光共聚焦观察不同干预下足细胞胞核的NFAT2定性表达情况,NFAT2着染为红色,细胞核着染为蓝色,两种颜色重叠为紫色。NG组、渗透压对照组、11R-vivit组及CsA组的NFAT2均以表达于细胞质为主,胞核区仅有少量表达；而HG组、DMSO组及Ionomycin组的NFAT2不仅在细胞质中表达,还高表达于细胞的胞核中。其变化与Western blot检测结果相似。四、不同干预对足细胞凋亡的影响使用流式细胞仪,应用Annexin V/PI试剂盒检测各组细胞的凋亡情况。将Annexin V (+)/PI (-)定为凋亡细胞,结果显示：Glucose5.3mM作用足细胞12h、24h、48h,各组的凋亡率分别为：(10.00±2.04)%、(11.39±1.62)%及(12.99±2.22)%；Glucose20mM作用足细胞12h、24h、48h,各组的凋亡率分别为：(11.79±3.24)%、(15.08±3.35)%及(22.72±6.68)%；但是Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用足细胞48h,其凋亡率为(13.17±5.36)%,与Glucose5.3mM48h组相近,其差异不具有统计学差异(P渗透压对照组,NG组=0.174)；而Glucose20mM+11R-vivit100nM48h组足细胞的凋亡率为(13.62±3.82)%,比Glucose20mM组明显减少,其差异具有统计学意义(P11R-vivit组,HG48h组<0.001)。由此推测：高糖诱导足细胞凋亡呈时间依赖性,但这一过程不依赖于渗透压的升高,且通过抑制NFAT2的过度活化,可减少高糖诱导的足细胞凋亡。五、高糖增加Bax的表达Bax因子是细胞中的促凋亡因子。实时定量PCR和Western blot分析结果表明：Glucose20mM48h组,足细胞中Bax因子的mRNA和蛋白表达对比Glucose5.3mM48h组均显着增加(P HG48h组,NG48h组<0.01,P HG48h组,NG48h组<0.01)；但是Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM48h组与Glucose5.3mM48h组结果相似；而Glucose20mM+11R-vivit100nM48h组较Glucose20mM48h组明显减少(PHG48h组,11R-vivit48h组<0.01, P HG48h组.11R-vivit48h组<0.01也与Glucose5.3mM48h组相似。这与细胞凋亡的结果相符合。六、高糖增加足细胞中钙离子的浓度应用Fluo-3/AM标记Ca2+,激光共焦显微镜扫描不同刺激下足细胞内Ca2+浓度的变化。结果表明：Glucose20mM组、Glucose5.3mM+Ionomycin500nM组较Glucose5.3mM组钙离子内流随刺激时间延长均明显增加；但Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM组钙离子内流与Glucose5.3mM组相似。由此推测,浓度为20mM的葡萄糖可增加体外培养足细胞的钙离子内流,且该过程不依赖于渗透压的增加。结论高糖可能通过CaN/NFAT2/Bax信号通路介导足细胞的凋亡,阻断CaN/NFAT2/Bax信号通路可以减少高糖诱导的足细胞凋亡。