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随着社会经济的发展,肝癌的发生率在过去十年间显著增加,严重影响着人类的健康。肝癌常见的危险因素包括乙肝病毒、丙肝病毒、黄曲霉素B1、烟草以及酒精。新近研究发现脂肪性肝病也是肝癌的危险因素之一,大约有4%-22%的肝癌归因于脂肪性肝病。脂肪性肝病被定义为肝脏内脂肪病理性聚集,其第一个病理阶段就是脂肪肝,当肝细胞内脂肪堆积超过细胞总体积的5%时就可以诊断为脂肪肝。脂肪肝可继续进展为脂肪性肝炎,其病理表现为免疫细胞浸润,肝细胞气球样变,细胞内出现MDB（Mallory-Denk body）,血生化检查谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）增高。脂肪性肝炎可以直接发展成为肝癌,或者先发展成为肝硬化,进而进展为肝癌。因此,脂肪性肝炎目前被认为是导致肝癌发生的重要危险因素,但对其发生发展机制所知仍然有限。目前研究认为肝脏内胆固醇堆积而引起的脂毒性和氧化应激是造成正常肝脏发展为脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）甚至肝癌的重要原因。肝脏是胆固醇合成的最主要器官,其中SREBP2（sterol-regulatory element binding protein 2）是调节胆固醇合成的关键转录因子。在正常生理状态下,SREBP2可被SCAP（SREBP cleavage-activating protein）剪切,随后SREBP2转位入核活化下游胆固醇合成和摄取相关基因的表达,包括HMG辅酶A还原酶（HMG-Co A reductase,HMGCR）和LDL受体（LDL receptor,LDLR）。HMGCR是胆固醇合成的限速酶,其酶活性直接影响了肝内胆固醇的合成能力,研究发现HMGCR的活性可在不同的层面被精密调控,包括转录水平、翻译水平、酶降解速率、磷酸化-去磷酸化修饰和反馈抑制等。其中HMGCR在872位点发生丝氨酸磷酸化修饰可直接抑制其酶活性,在肝脏内HMGCR的磷酸化主要受到激酶AMPK（AMP-activated protein kinase）的调控,体外实验发现HMGCR可被多种激酶磷酸化,如AMPK,PKC（protein kinase C）和CAMK（Ca M Kinases）等,其中AMPK的磷酸化活化可直接介导HMGCR 872位点的丝氨酸磷酸化,进而抑制HMGCR的功能和肝脏胆固醇合成。同时肝脏也是胆固醇代谢的重要场所,机体通过多种方式维持肝内胆固醇的稳态,包括将胆固醇转化为胆汁酸排入胆汁,通过三磷酸腺苷盒转运体A1将胆固醇直接排入胆汁,以及通过结合低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）使胆固醇进入血液等。但目前对于肝脏内胆固醇合成和代谢的调控机制的理解还不够透彻,因此完善对肝脏内胆固醇合成和代谢的精密调控可以为脂肪性肝病特别是脂肪肝的治疗提供重要依据。天然免疫系统是机体抵御病原体入侵的第一道防线。在病毒感染机体并活化机体抗病毒天然免疫应答的过程中,病毒成分如病毒RNA能够被机体免疫细胞的RLH（RIG-I-like helixases）识别,进而活化下游抗病毒天然免疫应答信号通路,促使免疫细胞活化并表达促炎症细胞因子和Ⅰ型干扰素（interferon,IFN）,从而清除病毒感染。RLH是病毒RNA的主要识别受体,包括两个成员:RIG-I（retinoic acid inducible gene I）和MDA5（melanoma differentiation-associated gene 5）。在RNA病毒感染细胞后,RLH的表达能够被显著上调,进而发挥增强病毒RNA识别及活化其下游抗病毒信号通路的作用,达到清除病毒感染的目的。RIG-I的分子结构主要由三部分组成:N端的2个重复CARD（caspase activation and recruitment domain）结构域、中间的RNA解螺旋酶结构域以及C端的RNA结合结构域。研究表明,RIG-I主要识别5’端磷酸化的病毒RNA,主要包括水泡性口炎病毒、新城鸡瘟病毒、仙台病毒、流感病毒和乙型脑炎病毒等。RIG-I识别病毒RNA后,其分子构像发生改变,N端的CARD结构域暴露并与下游位于线粒体膜表面的接头分子MAVS（mitochondrial antiviral signaling protein）结合,进而促使TRAF3（TNF receptor associated factor 3）活化,激活下游两条主要的信号通路:一是通过结合FADD（fas-associating protein with a novel death domain）进而活化转录因子NF-κB（nuclear factor kappa-B）,激活促炎症细胞因子的表达;二是通过活化TBK1（TANK binding kinase 1）进而活化下游的IRF3（interferon regulatory factor 3）和IRF7（interferon regulatory factor 7）,促使细胞表达Ⅰ型干扰素从而清除病毒感染。RIG-I除在抗病毒天然免疫过程中发挥重要作用之外,在免疫调节中的作用也受到广泛关注。本课题组研究发现,RIG-I在干扰素效应信号通路中能够发挥增强I型干扰素效应的作用,具体分子机制为RIG-I能够与I型干扰素效应信号JAK-STAT1通路中STAT1（signal transducers and activators of transcription1）分子结合,进而竞争性抑制STAT1负向调控分子SHP1与STAT1的结合,实现STAT1分子的持续性活化,从而发挥增强I型干扰素效应信号通路活化的作用。然而在研究RIG-I调控干扰素效应信号通路的同时,我们发现在DEN（diethylnitrosamine）诱导的小鼠肝癌发生模型中,Rig-I基因敲除小鼠相较于同窝的对照小鼠其肝癌发生显著增加,但是,Rig-I敲除对DEN所诱导的IL-6（interleukin 6）表达并无显著影响。这些结果强烈提示RIG-I极有可能通过抑制IL-6效应信号通路,进而抑制DEN所诱导的肝脏肿瘤发生。我们进一步使用IL-6体内刺激小鼠肝脏,发现在Rig-I敲除小鼠中肝细胞STAT3（signal transducers and activators of transcription 3）磷酸化水平显著增高,进而介导肝脏炎癌转化增加。这些结果说明在炎癌转化的小鼠肝癌模型中,RIG-I能够通过抑制IL-6效应信号通路,进而抑制肝脏肿瘤发生,本工作正处于总结投稿的过程之中。然而,在STZ（streptozocin）加高脂饮食（high-fatty diet,HFD）诱导的小鼠肝癌发生模型中,和DEN诱导的肝癌发生结果恰恰相反,Rig-I肝细胞特异性敲除(Rig-Ihep-/-)小鼠肝癌发生明显下降,并伴随着肝脏脂肪性肝炎的显著缓解。进一步在MCD（methionine-choline deficient diet）以及CD（choline deficient diet）饮食诱导的NASH小鼠模型中,我们发现Rig-Ihep-/-小鼠肝脏脂肪性肝炎相较于对照小鼠也显著缓解。并且在Rig-Ihep-/-小鼠中HFD饮食无法诱导小鼠肝脂肪化形成。上述结果表明,RIG-I能够促进脂肪肝的发生发展。通过检测小鼠血清生化指标,我们发现Rig-Ihep-/-小鼠血清内及肝脏内胆固醇含量显著低于对照组,而甘油三酯含量改变相对较小。这些结果强烈提示Rig-I肝细胞特异性敲除极有可能通过抑制肝脏内胆固醇的堆积,进而抑制高脂饮食诱导脂肪肝的发生发展。为了研究RIG-I抑制胆固醇在肝脏内堆积的机制,我们对Rig-Ihep-/-和对照(Rig-Ifl/fl)小鼠的肝脏进行了转录组学分析。转录组学检测结果表明,有关胆固醇合成、转运以及排泄的相关酶的m RNA水平在Rig-I肝细胞特异性敲除后都没有明显的改变。随后,我们利用Western blot技术在蛋白以及蛋白磷酸化水平层面对肝脏内胆固醇代谢相关酶进行了筛选。实验结果表明在肝细胞特异性敲除Rig-I后,肝脏HMGCR的磷酸化水平显著增加,而HMGCR的磷酸化修饰可以导致其失活。因此,RIG-I通过抑制HMGCR的磷酸化,进而促进了肝脏胆固醇的合成以及脂肪肝进展。鉴于HMGCR的磷酸化失活由其上游AMPKα实施,我们随后检测了RIG-I是否调控AMPKα与HMGCR结合进而抑制HMGCR磷酸化修饰。通过免疫共沉淀技术,我们发现RIG-I能够和AMPKα组成性结合。并且RIG-I与AMPKα发生结合的部位分别是RIG-I的CARD结构域和AMPKα的激酶域,AMPKα的激酶域同时也负责结合HMGCR的催化域。因此,RIG-I能够组成性地结合AMPKα从而竞争性抑制HMGCR磷酸化,进而导致胆固醇的合成增加。蛋白的翻译后修饰（post-translationalmodifications,PTM）对于蛋白之间的相互作用非常重要,而RIG-I也组成性地存在一些常见的翻译后修饰,如K18,K146的甲基化,K48,K95和K172的乙酰化修饰。那么这些修饰是否能够影响RIG-I与AMPKα的结合呢?为了研究这一问题,我们构建了相应的突变体,发现模拟K18以及K146去甲基化的突变体K18A、K146A能够显著减弱RIG-I与AMPKα的结合,而模拟K18与K146甲基化增强的突变体K18M、K146M能够促进RIG-I与AMPKα的结合,说明K18、K146是二者结合的关键位点。为了验证这一结果,我们进一步构建了RIG-I K18A以及K146A双位点突变小鼠并经过HFD诱导,发现突变小鼠与野生小鼠相比其脂肪肝进展明显缓解,并且肝脏以及血清内的胆固醇含量也显著下调。提示K18以及K146位点甲基化的RIG-I能够组成性地结合AMPKα,进而抑制HMGCR磷酸化并增加胆固醇合成。尽管胆固醇增多能够促进脂肪肝的进展,但它被熟知的作用还是作为动脉粥样硬化最重要的危险因子,因此我们进一步探究了肝脏RIG-I是否能影响动脉粥样硬化的进展。在动脉粥样硬化小鼠模型中分别敲低或者敲除Rig-I后,我们发现小鼠主动脉弓的粥样硬化斑块都有不同程度的缓解。因此,肝脏RIG-I可能也是动脉粥样硬化的一个潜在的干预靶点。综上所述,在本研究中我们发现了RIG-I促进肝细胞胆固醇合成,进而促进脂肪肝以及动脉粥样硬化的作用,揭示了RIG-I促进脂肪肝以及动脉粥样硬化发生发展的机制,为脂肪肝以及动脉粥样硬化的干预提供了新的潜在依据。