冠状病毒可引起人和动物的多种疾病，其中人类冠状病毒可引起10％-30%的普通感冒，亦可引起如SAPS等严重传染病。我国是冠状病毒的主要分布地之一，因此开展冠状病毒致病机制的研究对于提高我国应对此类疾病的防控能力具有重要意义。　　 但目前出于生物安全方面的考虑，针对SARS-CoV致病机制的研究受到了严重的制约。在这种情况下，与SARS亲缘关系较近的鼠肝炎冠状病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)便成为较为理想的研究对象。这是因为：第一，鼠肝炎冠状病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)与SARS冠状病毒（SARS-CoV）同属于Ⅱ组冠状病毒，两者的亲缘关系较近；第二，MHV是Ⅱ组冠状病毒的代表株，它具有良好的动物模型；第三，MHV对人不致病，易于开展实验研究，其研究成果对人类疾病也更具有指导意义。　　 研究表明，MHV和SARS-CoV的非结构蛋白l(Non-Structural Protein1．NSPl)具有抑制宿主抗病毒反应的功能，是冠状病毒的重要致病因子。并且通过配对分析发现，在MHV和SARS-CoV NSPl中存在着一段高度保守的氨基酸序列-LLRKxGxKG。该序列可能是NSPI的重要功能域，与MHV NSPI和SARS-CoV NSP1共同具有的某些功能有关。这值得我们进行深入的研究。　　 因此，本研究以MHV为研究模式株，从Ⅱ组冠状病毒MHV与SARS-CoV NSP1内高度保守的氨基酸序列-LLRKxGxKG入手，对该保守序列进行缺失突变，分别构建了MHV NSPI突变基因及MHV突变体。通过检测LLRKxGxKG序列缺失前后NSPI蛋白的功能变化，并分析MHV突变体的复制能力，以及对小鼠的致病力和组织嗜性等方面的变化，从分子、细胞和动物三级水平上揭示II组冠状病毒NSPI及其保守序列LLRKxGxKG的功能。以期加深我们对SARS-CoV等Ⅱ组冠状病毒致病机制的了解，并为抗病毒药物的设计和新型减毒疫苗的研制提供参考。一、鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1及其保守序列LLRKxGxKG的体外功能研究　　 首先，我们分别构建了MHV NSPI的真核表达质粒(pcDNA3.1-NSPl)及LLRKxGxKG序列缺失的突变NSPI真核表达质粒(pcDNA3.10NSPI-mu)。为检测MHV NSPl对IFN-B生成的影响，我们分别用pcDNA3.I-NSPl和pcDNA3.1-NSPl-mu转染L929细胞，利用新城疫病毒(new-castle disease virus，NDV)刺激诱导后，检测细胞上清中IFN-B的表达水平。结果显示，瞬时表达MHV NSPI或缺失突变NSPI分别使IFN-B的表达水平下降了12.8%和18.4%，两者之间的差异无统计学意义。这表明MHV NSPl对IFN-B的生成具有一定的抑制作用，但LLRKxGxKG序列与此功能无关。　　 为进一步分析MHV NSPI对IFN-13信号通路的影响，我们用报告质粒(-110-IFNB)-CAT和ISRE-Luc分别与真核表达质粒pcDNA3.I-NSPl或lx:DNA3.I-NSP l-mu进行共转染。通过检测CAT和Luc报告基因表达水平，分析MHV NSPI及保守序列LLRKxGxKG对IFN-8启动予和IFN刺激应答元件活性的影响。结果发现，在进行刺激诱导的情况下，与空载体对照组相比，pcDNA3.I-NSPl和pcDNA3.I-NSPI-mu转染组的报告基因表达水平均显著下降(P<0.01)，且两组间差异无统计学意义(P>0.05)。这表明，MHV NSP1可显著抑制IFN-B启动子和IFN刺激应答元件的活性，并且该抑制作用不受LLRKxGxKG序列缺失的影响。　　 上述实验中我们偶然发现，在不进行刺激诱导的情况下，LLRKxGxKG序列缺失前后MHV NSP1对报告基因的抑制作用有显著变化。根据文献报道，SARS-CoV NSPl具有抑制宿主基因表达的功能。为检验MHV NSPI是否具有相同功能，我们另外选择了三种报告质粒（pRLuc-CMV、pGL3-basic和pGL3-control）分别与pcDNA3.1-NSPI或pcDNA3.1-NSP l-mu共转染，并检测报告基因的表达水平。结果发现，与空载体对照组相比，pcDNA3.1-NSPl和pcDNA3.1-NSPl-mu转染组的报告基因表达水平均显著下降(P<0.01)，但当LLRKxGxKG序列缺失后，该抑制作用显著降低(P<0.01)。该结果表明，MHV NSP1具有抑制共转染基因表达的功能，LLRKxGxKG序列在此过程中发挥重要作用。这提示我们，LLRKxGxKG序列是MHV NSPI的重要功能域，它对宿主基因的表达可能具有同样的抑制作用，值得进行深入研究。二、LLRKxGxKG序列缺失的鼠肝炎冠状病毒突变体的拯救　　 为深入了解MHV NSPl内保守序列LLRKxGxKG与病毒致病性的关系，我们利用以痘苗病毒为载体的MHV反向遗传学系统，构建了LLRKxGxKG序列缺失的MHV突变体，以便对LLRKxGxKG序列的功能进行研究。　　 首先，利用含鼠肝炎冠状病毒基因组全长cDNA的重组痘苗病毒(VacciniaVirus-inf-1(V.V.-inf-1)介导的同源重组，以大肠杆菌gpt(guanine-phosphoribosyltransferase)基因作为双向筛选标记，通过GPT-in和GPT-out两轮重组，用NSP1突变基因替换掉原MHV基因组的NSPI基因，经过筛选、纯化，获得含突变MHV基因组的重组痘苗病毒（V.V.-MHV-NSPl mu）。然后，扩增V.V.-MHV-NSPl mu并提取病毒DNA，经酶切获得突变的MHV基因组全长cDNA，并以此为模板通过体外转录，得到突变的MHV基因组全长RNA，进而转染BHK-21细胞。经对转染后得到重组MHV的鉴定，证明成功地拯救到了LLRKxGxKG序列缺失的MHV突变体，命名为MHV-NSP1⊿27。通过测定病毒生长曲线发现，MHV-NSP1⊿27在体外仍可高效复制，其病毒滴度可达8×106PFU/ml，略低于野生型MHV(2x107pFU/ml)．三、LLRKxGxKG序列缺失的鼠肝炎冠状病毒突变体的毒力分析　　 为进一步了解LLRKxGxKG序列与病毒致病性的关系，我们选择了3-4周龄雄性C57BL/6小鼠，分别开展野生型MHV与LLRKxGxKG序列缺失的MHV突变体的感染实验。结果显示，腹腔感染(5×106PFU)时，野生型MHV的致死率为87.5%，而MHV-NSP1⊿27的致死率为37.5%；脑内感染(2×104pFU)时，野生型MHV的致死率为100%，而MHV-NSP1/127对小鼠完全不致死。由此得出结论：LLRKxGxKG序列缺失后，MHV突变体对C57BL/6小鼠的致病力大大降低。经过检测发现，MHV-NSP1⊿27感染后小鼠肝和脾的病毒滴度显著低于野生型MHV，并且MHV-NSP1⊿27很快就被机体清除，2天后已检测不到病毒。同时，感染小鼠的血清ALT检测结果显示，MHV-NSP1⊿27致小鼠肝脏损伤的程度远远低于野生型MHV。攻毒实验结果表明，MHV-NSP1⊿27保留了较好的免疫原性，对野生型MHV感染具有良好的保护效果。　　 本研究表明，LLRKxGxKG序列是MHV的一个重要毒力位点，该序列缺失后，MHV突变体对小鼠的致病力显著降低，同时可有效诱导机体产生免疫保护，因而LLRKxGxKG序列缺失的冠状病毒突变体可作为一个很好的减毒疫苗候选株。鉴于MHV与SARS-CoV NSPI内LLRKxGxKG序列的高度保守性，本研究结果对于SARS-CoV等Ⅱ组冠状病毒致病机制的研究以及减毒疫苗的研制都具有重要的参考价值。但目前，LLRKxGxKG序列作用的具体机制尚不清楚，仍需进一步的研究。　　 另外，本研究应用以痘苗病毒为载体的冠状病毒反向遗传学系统，在国内首次成功拯救得到了重组冠状病毒。这为我们开展冠状病毒的相关研究提供了良好的技术平台，同时该系统对于其他病毒反向遗传学系统的构建也具有重要的借鉴意义。