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第一部分SYB对肝癌细胞增殖的影响。目的:研究红花黄色素B对肝癌细胞生长增殖的影响。方法:通过CCK-8法检测不同浓度的SYB对HepG2细胞增殖的影响。分别用终浓度为50,100,150,200nmol/mlSYB,分别培养12h,24h,36h和48h。用CCK-8计算细胞的生长率。采用Annexin V/PI流式细胞分析法进行了凋亡率的定量研究,检测HepG2细胞经0、50nmol/ml、100nmol/ml、150nmol/ml、及 200nmol/ml 处理后的凋亡率。结果:随着SYB作用时间的增长,HepG2细胞的增长率逐渐变化,当SYB的浓度为150nmol/ml、在作用36h时,HepG2细胞的的生长情况最差。在HepG2凋亡率中,SYB0组与其它各组比较,有显著性差异;晚期凋亡率中,当SYB的浓度为150nmol/ml、及200nmol/ml时与空白对照组差异显著,呈剂量依赖关系。结论:SYB可以抑制HepG2细胞生长、抑制HepG2细胞增殖活性、诱导肿瘤细胞凋亡。第二部分SYB作用后miR34a在肝癌细胞HepG2中的表达。目的:寻找SYB作用后miRNA中变化较为剧烈的miRNA而后对其表达情况进行研究分析。方法:使用浓度为150nmol/mlSYB作用于肝癌细胞HepG2后,基因芯片检测miRNA表达的变化。然后用定量PCR对此miRNA表达进行研究。结果:受SYB影响的miRNA有19个,其中miR-34a变化最明显。与Omin的表达量相比,在20min、40min和60min的miR-34a在mRNA水平上的表达量均显著增高(P<0.05),而在40min和60min的miR-34a在mRNA水平上的表达量则明显高于20 min的表达量(P<0.05),而40min和60min的miR-34a在mRNA水平上的表达量则没有明显差别(P>0.05)。结论:在SYB作用40min后,miR-34a在mRNA水平上的表达量已经达到最佳状态。第三部分SYB作用后p53,caspase-9及相关蛋白在肝癌细胞HepG2中的表达。目的:SYB作用于肝癌细胞HepG2后细胞内p53及线粒体途径的蛋白表达情况进行初步研究。方法:用 Western blot 的方法对 p53,caspase3(剪切后),caspase 9,caspase 8,Bcl-2的表达量进行分析,同时对条带灰度值进行分析。结果:随着SYB作用时间的增加,Bcl-2的表达量逐渐降低,20min的Bcl-2的表达量与Omin相比,没有明显差别(P>0.05)。而40min和60min的Bcl-2的表达量与Omin相比,结果显著降低(P<0.05),与20min的Bcl-2的表达量相比同样显著降低(P<0.05)。而40min和60min的Bcl-2的表达量没有显著差异(P>0.05)。而p53,caspase 3(剪切后),caspase 8,caspase 9 的表达量逐渐升高。20min、40min 和 60min 的 p53的表达量与Omin相比,结果显著升高(P<0.05),40min和60min与20min的p53的表达量相比同样显著增高(P<0.05)。而40min和60min的p53的表达量没有显著差异(P>0.05)。结论:SYB可以诱导HepG2细胞凋亡,其基本原理可能通过以下途径:SYB可以增强p53基因的转录水平,从而激活下游的Bax基因转录,抑制了 Bcl-2基因的转录,使p53蛋白和Bax蛋白的表达量增高;Bcl-2蛋白的表达量下降,其基本原理是p53蛋白和Bcl-2蛋白结合了,或是Bcl-2自身形成了二聚体,使其的特异性孔道开放,释放出细胞色素C,从而导致caspase的级联反应,导致细胞凋亡。第四部分p53抑制后miR34a和caspase9及其相关蛋白表达的变化。目的:p53在此过程中对miR-34a的作用,及其他相关蛋白表达的影响进行研究。方法:用150nm的p53抑制剂作用于肝癌细胞HepG2后12h,用终浓度为150nmol/l的SYB作用于肝癌细胞HepG2,并与作用0,20min,40min和60min收集细胞,检测miRNA,做Western实验。并检测SYB组,SYB加p53抑制剂组,和不加SYB组的细胞增殖情况。结果:加入p53抑制剂后miR34a在mRNA水平上在各个时间段的表达量几乎没有变化,差异不显著(P>0.05)。与相应时间段的只加SYB的对照组相比,表达量明显降低(P>0.05)。p53,caspase3(剪切后),caspase 9,caspase 8,Bcl-2的表达量均没有明显变化。随着作用时间的增加,肝癌细胞HepG2的增殖率也在增加,在24h,36h和48h的细胞增殖百分比显著高于12h的(P<0.05),36h和48h的细胞增殖百分比显著高于24h的(P<0.05),而在36h和48h的细胞增殖百分比则无明显变化(P>0.05)。结论:p53对miR34a的表达量有控制作用。第五部分miR34a抑制后p53和caspase9及其相关蛋白表达的变化。目的:当miR34a抑制后,p53和caspase9及其相关蛋白表达的变化进行研究。方法:用RNA干扰的方法将miR34a抑制后,western blot检测了 p53,caspase3(剪切后),caspase9,caspase8,Bcl-2 的表达量,cck-8检测了 HepG2的增殖情况。结果:当miR34a抑制后,随着SYB作用时间的增加,Bcl-2的条带逐渐变浅,20min的Bcl-2的表达量与Omin相比,没有明显变化(P>0.05)。而40min和60min的Bcl-2的表达量与Omin相比,显著降低(P<0.05),与20min的Bcl-2的表达量相比同样显著降低(P<0.05)。而40min和60min的Bcl-2的表达量没有显著差异(P>0.05)。caspase8的表达量在20min的caspase 8的表达量与Omin相比,没有明显变化(P>0.05)。而40min和60min的caspase 8的表达量与Omin相比,显著升高(P<0.05),与20min的caspase 8的表达量相比同样显著升高(P<0.05)。在20min,40min和60min的caspase 3(剪切后),caspase 9的表达量与Omin相比,显著升高(P<0.05),40min和60min与20min的caspase 3(剪切后),caspase 9的表达量相比同样显著增高(P<0.05)。而 40min 和 60min 的 caspase 3(剪切后),caspase 8,caspase 9 的表达量没有显著差异(P>0.05)。肝癌细胞HepG2的增殖率也在增加,在24h,36h和48h的细胞增殖百分比显著高于12h的(P<0.05),36h和48h的细胞增殖百分比显著高于24h的(P<0.05),而在36h和48h的细胞增殖百分比则无明显变化(P>0.05)。结论:miR-34a通过对Bcl-2的调控实现了对细胞凋亡的调控。