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目的课题通过大鼠胆总管结扎术(CBDL)复制胆汁淤积性肝炎重症模型,观察该法诱导的胆汁淤积性肝炎大鼠造成的肝损伤特点,通过对药物疗效作用机理研究,结合体征观察与现代指标检测,探讨清开灵注射液对胆汁淤积性肝炎大鼠肝损伤的保护作用,对相应证候的干预作用,及抗炎、抗内质网应激相关途径的影响。方法(1)雄性SD大鼠,SPF级,35只,体质量250-270g,应用手术方式制备CBDL模型,手术方法为游离胆总管并双重结扎后于节间切断,随机分为4组,分别为空白对照组(空白组),CBDL模型组(模型组),以上两组给予等体积生理盐水,熊去氧胆酸UDCA阳性治疗组(UDCA组),造模同时以78mg/kg剂量灌胃给药,清开灵注射液治疗组(清开灵组),造模同时以3mL/kg剂量腹腔注射给药,两周干预时间。干预给药同时对胆汁淤积型肝炎大鼠各组进行两周证候观察,分别采集基本体征信息并记录(有则记1,无则记0);进行每周一次基本体重、饮水量、饮食量、基础体温、耳微血流的采集;取材前对舌象,爪象进行采集。(2)对实验过程中采集望诊信息表运用聚类分析法、决策树算法对模型特征进行归纳,对采集到的大鼠舌象、爪象进行RGB数字量化图像分析统计处理。(3)对大鼠肝脏组织进行HE染色、Masson染色、TUNEL凋亡染色相关病理检测。(4)对大鼠肝组织进行羟脯氨酸含量(Hyp)、肝脏指数的测定。(5)对大鼠血清指标AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)、GGT(Y谷氨酰转肽酶)、TBIL(总胆红素)、DBIL(直接胆红素)、IBIL(间接胆红素)进行检测。(6)采用酶联免疫吸附分析法(Elisa)检测大鼠血清、大鼠肝脏组织匀浆上清液中的炎症因子 TNF-α、IL-6、IL-1β、NLRP3。(7)以蛋白质印迹法(Western blot)检测大鼠肝脏组织中GRP78、Caspase-12、NLRP3、SLC10A1等指标,检测清开灵注射液通过调控内质网应激及抑制炎症反应起到治疗作用。结果(1)胆汁淤积性肝炎大鼠与正常组大鼠相比,其肝脏功能指标ALT、AST、GGT明显升高(P<0.001),清开灵组大鼠血清中ALT,AST,GGT的指标偏低(p<0.05);模型组大鼠肝脏指数升高(P<0.001),清开灵组大鼠肝脏指数降低(P<0.001);肝脏中羟脯氨酸含量升高(P<0.05),清开灵组大鼠肝脏中羟脯氨酸含量降低,(P<0.01);HE染色结果显示清开灵组大鼠纤维间隔内胆小管增生,细胞间质轻微水肿伴炎性细胞浸润,肝细胞排列疏松紊乱;MASSON染色提示清开灵组汇管区及纤维间隔内胆小管增生处胶原纤维蓝增多,但未完全分割肝脏实质细胞,未形成明显纤维桥接。(2)模型组胆汁淤积性肝炎大鼠与正常组大鼠血清相比TNF-α、IL-6含量增高(P<0.001);肝脏组织中的TNF-α、IL-6、IL-1β、NLRP3含量明显比正常组含量增多(P<0.01);清开灵组大鼠肝脏组织中的TNF-α、IL-6、IL-Iβ、NLRP3含量明显比模型组大鼠含量降低(P<0.05);清开灵组大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β含量降低(P<0.05);模型组大鼠与正常组大鼠相比GRP78、Caspase-12、NLRP3、SLC10A1指标蛋白相对表达量增加(P<0.001)。清开灵组大鼠肝脏组织中的GRP78、Caspase-12、NLRP3、SLC10A1指标蛋白相对表达量降低(P<0.01);凋亡染色结果提示清开灵组肝脏组织中凋亡细胞量介于模型组与UDCA治疗组之间。(3)体征采集结合量化指标观察到胆汁淤积性肝炎大鼠表现为身热,口渴不甚,烦躁,鼻衄,多怒撕咬,小便色深黄,舌质偏红等症状;与正常组大鼠相比,模型组体重减轻(P<0.001);与正常组大鼠相比,模型组大鼠基础体温偏高(P<0.05),清开灵组比模型组体温降低(P<0.00);模型组大鼠的耳廓微血流流速增高,清开灵组比模型组耳廓微血流流速降低(P<0.05);模型组大鼠比正常组大鼠舌象R/(R+G+B)值明显偏高(P<0.001),清开灵组大鼠比模型组大鼠舌像Red值偏低(P<0.01);模型组大鼠爪象比正常组R/(R+G+B)值明显偏高(P<0.001),清开灵组比正常组Red值偏低(P<0.01),模型组大鼠的血流变全血粘度低切、中切、高切均比正常组的全血粘度数值偏高(P<0.05),清开灵组比正常组的全血流粘度中切、高切均偏低(p<0.05);模型组体征特征为消瘦、多怒撕咬、步态不稳、毛少光泽、毛枯黄、眼神暗淡无神、耳色红、鼻孔血痕、唇色暗红、小便色黄、量少、爪色红。结论(1)CBDL手术模型可以较好的模拟胆汁淤积性肝炎肝损伤疾病特点,清开灵注射液可以较好保护胆汁淤积性肝炎造成的肝损伤,但对胆汁淤积性肝炎的肝纤维化进程可能无法逆转。(2)胆汁淤积性肝炎损伤后引起了机体的炎症反应,可能同时诱导了内质网应激反应;清开灵注射液可以通过抗炎途径、抗内质网应激途径治疗CBDL诱导的胆汁淤积性肝炎,一定程度上可以抑制钠依赖性胆汁酸盐地吸收而缓解胆汁淤积的进程。(3)胆汁淤积性肝炎重症模型,运用体征采集结合多种量化指标验证法,结果发现CBDL胆汁淤积性肝炎大鼠符合热毒血瘀证的特点,清开灵注射液对该证候有干预作用。