获得性伊马替尼耐药以慢性粒细胞白血病患者细胞内Bcr-Abl突变作为特征,这种突变抑制了伊马替尼与酪氨酸激酶结合。Bcr-Abl T315I位点突变是获得性伊马替尼耐药的主要机制。因此,寻找克服伊马替尼耐药的治疗方法和靶向策略是目前急需的。我们最近已经报道,氧化吡啶巯基镍(Nickel pyrithione,NiPT)能够通过19S蛋白酶体相关的去泛素化酶(USP14和UCHL5)靶向抑制作用,抑制泛素蛋白酶体系统,但这并不影响20S蛋白酶体功能。因此,接下来,我们将进一步探讨:(1)NiPT不仅能够诱导伊马替尼敏感型和伊马替尼耐药型细胞产生凋亡,还能够抑制裸鼠移植瘤生长;(2)NiPT通过下调Bcr-Abl mRNA水平及蛋白酶体抑制作用诱导caspase激活,从而下调Bcr-Abl表达;(3)19S蛋白酶体相关去泛素化酶抑制作用介导caspase激活和细胞凋亡。这些结果表明,NiPT通过Bcr-Abl依赖与非依赖机制,克服伊马替尼耐药,为慢性粒细胞白血病的治疗提供了重大的临床意义。为此,本课题以氧化吡啶巯基镍(Nickel Pyrithione,NiPT)在慢性粒细胞白血病伊马替尼敏感型和伊马替尼耐药型细胞中的作用展开了具体的探讨,进行如下实验:1、NiPT降低IM-敏感型和IM-T315I突变型细胞活力分别在以下细胞中使用不同浓度的NiPT作用48小时:伊马替尼敏感型细胞系KBM5、BaF3-p210-WT,伊马替尼耐药型Bcr-Abl-T315I突变型细胞系KBM5R和BaF3-p210-T315I细胞,及Bcr-Abl野生型细胞系K562细胞。所有慢性粒细胞白血病细胞活力均有明显的剂量依赖性降低,50%抑制浓度(IC50)在KBM5、KBM5R、BaF3-p210-WT、BaF3-p210-T315I及K562细胞中分别是0.14,0.17,0.3,0.16和0.98μM。用台盼蓝染色法进一步检测NiPT对慢性粒细胞白血病细胞的活力效应。所有的细胞系的细胞活性均呈时间和剂量依赖性的抑制,这反映了NiPT在慢性粒细胞白血病细胞中的抗肿瘤活性。2、NiPT诱导IM-敏感型和IM-T315I突变型细胞凋亡我们评估NiPT诱导IM-敏感型和IM-T315I突变型细胞死亡的能力。不同浓度的NiPT处理KBM5、KBM5R、K562、BaF3-p210-WT及Ba F3-p210-T315I细胞后,通过在倒置荧光显微镜记录Annexin V/PI双阳性细胞数,我们观察到细胞时间依赖性死亡的比例不断增加。这些结果均支持NiPT诱导细胞凋亡这一结论。3、NiPT诱导细胞凋亡与caspase激活及抗凋亡蛋白表达下调相关为了探索NiPT诱导慢性粒细胞白血病细胞凋亡的机制,不同时间及浓度的NiPT处理IM-敏感型和IM-T315I突变型细胞后,我们对凋亡相关蛋白的表达水平进行了检测。NiPT能够显著地增加细胞凋亡标志蛋白PARP的切割。同时,数据表明NiPT剂量和时间依赖性地激活了caspase 3、caspase 8和caspase 9级联反应。线粒体是细胞凋亡的调节中枢,这是一个被广泛接受的概念。因此我们接下来研究NiPT是否影响细胞线粒体膜的完整性。研究结果表明,用NiPT处理所有慢性粒细胞白血病细胞后,其线粒体膜的完整性均有下降。细胞色素C(Cytochrome C)和细胞凋亡诱导因子(AIF)从线粒体内释放到细胞质中,这一过程被公认为凋亡的早期标志。因此我们认为NiPT触发了线粒体途径,且Cyto C和AIF的释放增加发生于较早的时间点,这表明NiPT激活了慢性粒细胞白血病细胞的线粒体凋亡通路。为了进一步探讨NiPT诱导凋亡的机制,我们还检测了凋亡相关蛋白的表达水平。结果表明,抗凋亡蛋白Mcl-1,XIAP,Bcl-2和Survivin的表达明显下降。4、NiPT诱导的蛋白酶体抑制与内质网应激及细胞凋亡相关可以确定的是,去泛素化酶或蛋白酶体的抑制作用均导致泛素化蛋白质的聚集。与我们先前在其他癌症细胞中曾报道的类似,在慢性粒细胞白血病细胞中,NiPT剂量和时间依赖性地诱导泛素化蛋白质(Ubs)和蛋白酶体底物蛋白p27的积累,这种现象发现在PARP切割之前。特别地是,Ni PT并不改变KBM5、KBM5R细胞的20S蛋白酶体活性。蛋白酶体抑制剂,硼替佐米,作为20S蛋白酶体抑制剂的阳性对照。根据我们之前的报道,NiPT可以以19S蛋白酶体相关的去泛素化酶作为靶点,有效地抑制泛素蛋白酶体系统。在KBM5R细胞裂解液中,NiPT能够与HA-UbVS竞争性结合USP14和UCHL5位点。此外,USP14的磷酸化水平也有大幅减少,这也表明了NiPT对USP14的去泛素化酶活性抑制作用。泛素化蛋白质的聚集会导致未折叠蛋白反应(UPR)和细胞凋亡。NiPT诱导产生内质网应激(ER-stress)实验表明,在KBM5和KBM5R细胞中,NiPT激活了PERK相关的内质网应激通路,p-eIF2a表达水平的升高是最好证明。这些结果均表明,NiPT在慢性粒细胞白血病细胞中介导的蛋白酶体抑制在其所诱导的内质网应激反应和caspase激活中起了重要作用。5、NiPT下调Bcr-Abl蛋白表达水平,并抑制其下游信号通路我们发现,NiPT能够剂量和时间依赖性地下调IM-敏感型和IM-T315I突变型细胞中总的和磷酸化的Bcr-Abl蛋白水平。进一步研究显示NiPT影响了Bcr-Abl下游靶蛋白的表达水平。STAT5,Akt和Crkl的磷酸化水平也呈剂量和时间依赖性降低,这发生于其总体蛋白水平下调之前。6、Bcr-Abl基因表达水平减少及caspase切割导致Bcr-Abl蛋白水平下调为了探讨NiPT在慢性粒细胞白血病细胞中所介导的Bcr-Abl表达水平下调的机制,我们分析了Bcr-Abl融合基因的转录水平。使用不同浓度的NiPT处理KBM5、KBM5R细胞6小时,RT-PCR结果显示Bcr-Abl的mRNA水平在一定程度上有所下降。虽然Bcr-Abl的mRNA水平降低程度明显低于相应蛋白水平的降低,但NiPT所致Bcr-Abl mRNA表达水平下调可能有助于对Bcr-Abl蛋白的减少。为了进一步研究这个问题,我们对RNA聚合酶II(RNA pol II)进行了分析。RNA聚合酶II的磷酸化水平在一定程度上是减少的。NiPT抑制RNA聚合酶的表达,从而下调包括Bcr-Abl突变型细胞的Bcr-Abl mRNA水平和蛋白水平。有报道称,Bcr-Abl可以被caspase切割。为了进一步探讨NiPT下调Bcr-Abl表达的机制,我们对Bcr-Abl与caspase活化之间的联系进行了研究。我们观察到,泛-caspase抑制剂ZVAD能够大部分逆转NiPT介导的细胞死亡及Bcr-Abl的下调,却不能够反转泛素化蛋白质的聚集。这表明,NiPT通过抑制蛋白酶体活性,激活caspase级联反应,从而下调Bcr-Abl及其下游通路的表达。7、NiPT在慢性粒细胞白血病原发性单核细胞中的体外活性研究接下来,我们进一步研究NiPT在12例慢性粒细胞白血病病人骨髓标本中的抗肿瘤作用(其中4例为IM-耐药病人)。结果显示,NiPT抑制病人原发性单核细胞活力,其IC50值在0.58μM到0.82μM之间。NiPT处理36小时后,流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示NiPT剂量依赖性诱导病人原发性单核细胞凋亡。同时,NiPT还能够显著地增加病人细胞中泛素化蛋白质及蛋白底物IκB-α聚集,激活caspase-3和caspase-9,减少PARP切割。这些结果表明,NiPT对病人原发性单核细胞的抑制作用与体外细胞系作用相一致,提示NiPT对慢性粒细胞白血病病人的潜在治疗作用。8、NiPT抑制IM-敏感型和IM-耐药型裸鼠移植瘤生长接下来,我们检测NiPT在裸鼠移植瘤中的应用。皮下接种KBM5和KBM5R细胞于裸鼠体内。与正常对照组相比,NiPT处理组中肿瘤的生长显著下降。且裸鼠体重相对稳定。药物处理组中Bcr-Abl及其下游靶点Akt、STAT5的表达均有明显地下调;泛素化蛋白质和泛素化蛋白底物P27明显聚集,提示NiPT能够同时抑制IM敏感型和IM耐药型细胞移植瘤的生长。同时,对增殖、分化、粘附相关标志蛋白,Ki67、CD11b/c和CXCR4的检测发现,NiPT能下调其蛋白表达。这些结果表明,NiPT能够有效抑制IM敏感型和IM耐药型裸鼠移植瘤生长。结论:NiPT通过下调Bcr-Abl转录水平和蛋白酶体抑制介导的caspase激活切割Bcr-Abl从而减少Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突变型细胞中Bcr-Abl的表达。同时,19S蛋白酶体相关去泛素化酶抑制作用在NiPT诱导的caspase激活和细胞凋亡中起着关键作用。我们在这里提出了一种通过下调Bcr-Abl表达从而克服伊马替尼耐药的非传统治疗方案,为慢性粒细胞白血病克服伊马替尼耐药的治疗提供重大的临床意义。此部分研究内容已经在《J Hematology Oncology》上发表,可以为今后NiPT的临床试验以及临床应用提供重要的理论依据。