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第一部分ICAM-1靶向载Ang-1基因微泡的制备目的构建载Ang-1基因微泡,超声照射微泡介导目的基因转染体外293T细胞,观察其转染效率,制备ICAM-1靶向载Ang-1基因微泡,检测连接效率,为寻求一种新型“血管新生基因—微泡—组织特异性配体”的三聚体式基因载体转染方法及进一步进行心肌缺血新生血管治疗的研究工作提供理论依据和经验。方法利用腺相关病毒pAAV Ang-1亚克隆构建EGFP-C3-hAng-1质粒,制备载Ang-1基因微泡。使用超声照射载Ang-1基因微泡转染体外培养293T细胞。实验分为A组：对照组；B组：超声照射+质粒组；C组：超声照射+质粒+微泡组；D组：脂质体+质粒组,每组重复6孔。按实验分组要求在无菌6孔培养板的悬浮293T细胞液内加入微泡、质粒和脂质体：A组加入终浓度为10ug/孔的EGFP-C3-hAng-1质粒,B组加入终浓度为10ug/孔的EGFP-C3-hAng-1质粒,C组加入SonoVue和EGFP-C3-hAng-1质粒的混合物,其中微泡终浓度为200ug/孔、质粒终浓度为10ug/孔,D组加入充分混匀的10ulDMEM稀释的脂质体(含脂质体4ul)和100ulDMEM稀释的EGFP-C3-hAng-1质粒(含EGFP-C3-hAng-1质粒10ug)将超声基因转染仪的探头置于6孔板底部对B组、C组悬浮细胞进行超声照射,照射参数设置为连续波、声强1.5W/cm2,照射时间30秒。荧光显微镜观察绿色荧光在293T细胞内的表达情况。48小时使用流式细胞仪分析检测瞬时表达效率。使用静电吸附法将标记有FITC的抗ICAM-1抗体稀释后与SonoVue微泡以1：2的体积比混合孵育,调整反应液pH值分别至4.0-5.0和8.0-9.0酸碱条件,静置待其分层后吸取上层悬浮泡沫,用PBS缓冲液重悬制备ICAM-1靶向SonoVue微泡。用荧光显微镜观察微泡发光情况,用流式细胞仪定量计算连接效率结果亚克隆法成功构建EGFP-C3-hAng-1质粒,测序结果经GeneBank人Ang-1基因联机同源比较证实与其原始序列完全一致。超声照射载Ang-1基因微泡,48小时后荧光显微镜下转染的培养293T细胞胞浆内出现绿色荧光,使用流式细胞仪测量A组、B组、C组、D组细胞Ang-1基因转染效率分别为(0.26±0.16)%、(1.38+0.22)%、(15.17+2.32)%、(7.17±2.64)%。抗ICAM-1抗体在pH值调整至4.0-5.0的酸性条件下,可与微泡大量结合,荧光显微镜观察到微泡聚集并可见明亮的绿色荧光,在pH值调整为8.0-9.0的碱性条件下,微泡发出绿色荧光明显减弱。流式细胞仪的结果显示在pH值分别为4.0-5.0和8.0-9.0条件下,抗ICAM-1抗体与Sono Vue微泡结合率分别为(54.97+9.51)%和(3.48+1.53)%。结论在一定条件下,超声照射载Ang-1基因微泡成功体外转染培养293T细胞,转染效率较高。成功制备高效连接的ICAM-1靶向微泡。为进一步开展靶向微泡携带基因超声局部定向照射转导外源性基因开展基因治疗提供实验依据。第二部分超声照射微泡瞬时转染血管内皮细胞及其促血管生成的研究目的探讨微泡联合超声照射将Ang—1基因瞬时转染血管内皮细胞系CRL—1730的表达情况及迁移效应。方法取对数生长CRL1730接种6孔板,实验分为4组：空白对照组、Ang—1组(10μ/ml)、微泡组(10%)、超声照射组(Ang-110μg/ml,微泡10%,超声照射30S),各组培养6小时换10%胎牛血清培养基,培养至24小时收集细胞,采用RT-PCR法检测各组细胞Ang-1mRNA表达水平,采用western-blot法检测Ang—1蛋白表达水平,选用transwell法检测细胞迁移力。结果空白对照组、Ang-1组、微泡组Ang-1mRNA及蛋白表达均无明显差异(p>0.05),超声照射组Ang-1mRNA及蛋白表达均明显高于以上三组(p<0.05),且超声照射组细胞迁移能力较前三组有明显提高(p<0.05)。结论超声联合微泡可将Ang-1基因瞬时转染入血管内皮细胞系CRL1730,表达Ang-1的血管内皮细胞具有更强的迁移能力。