林可霉素是林可酰胺类抗生素中的一种,在临床应用广泛。本课题以降低林可霉素B含量为目标,以渗透压调节为切入点,从摇瓶优化放大至15L发酵罐,并研究了渗透压影响林可霉素合成的机理。首先通过摇瓶实验确定林可霉素发酵合适的初始渗透压范围为0.860-1.355 Osmol/kg。利用中心组合设计对渗透压调节剂(氯化钠、氯化钾、氯化钙)与保护剂(甘油、甘露醇、甜菜碱、甘氨酸、脯氨酸)及抗氧化剂(半胱氨酸)进行组合优化,得到最优条件为:氯化钠10.93 g/L,甘油2.25 g/L,脯氨酸0.057g/L。摇瓶验证结果为,林可霉素B含量为1.42%,相比对照(3.58%)降低60.33%;产物林可霉素A效价为5795 U/mL,相比对照(4326 U/mL)提高33.96%。进一步在15 L发酵罐上研究渗透压调节对林可霉素发酵的影响,发现添加10 g/LNaCl后林可霉素B含量显著降低,放罐时,条件罐的林可霉素B含量(5.78%)相比对照罐(8.20%)显著降低29.51%。建立了林可链霉菌中含硫代谢物半胱氨酸、高半胱氨酸、麦角硫因等物质的测定方法。添加NaCl后半胱氨酸含量较对照低而高半胱氨酸含量更高,高半胱氨酸占比由30%提高到50%。S-腺苷甲硫氨酸的浓度提高为林可霉素的合成提供更多的甲基供体,从而降低林可霉素B含量。通过转录组测序技术,研究了林可霉素合成过程中基因组转录差异变化。添加NaCl后,发酵在41 h时有60个基因上调,124个基因下调;89h有103个基因上调,325个基因下调。其中41 h时林可霉素合成基因簇上的23个功能基因均显著上调,与发酵初期林可霉素合成速率高一致。但在89 h合成甲基硫林可酰胺部分的相关基因出现了下调,可能是导致发酵后期林可霉素A产量未能进一步提高的原因。实验还发现在渗透压刺激下糖酵解和HMP途径的大部分基因上调,而TCA途径中的基因下调,硫同化、半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、放线硫醇与麦角硫因合成相关基因上调,这些基因上调可以提供更多的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸及硫供体放线硫醇和麦角硫因,有利于提高林可霉素A产量与降低林可霉素B含量。