对美国白蛾高毒力苏云金芽孢杆菌的筛选及杀虫蛋白基因鉴定

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美国白蛾[Hyphantriacunea(Drury)]食性杂、繁殖量大、适应性强、传播途径广、危害严重,是一种世界性检疫害虫,在欧亚几十个国家危害非常严重,而对其进行无污染的有效和持续控制仍然是一个世界性的难题。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一种特异性极高且对环境友好的微生物杀虫剂,其cry基因是应用最为广泛和最有潜力的抗虫基因。因此,分离和筛选高毒力Bt菌株、鉴定杀虫蛋白基因并分离克隆新的杀虫基因,对研究Bt资源的多样性和害虫的生物防治具有十分重要的意义。本试验采用山东省17个地区的土壤中分离Bt菌株,通过生物测定筛选对美国白蛾幼虫具有高毒力的菌株,并对高毒力菌株的晶体蛋白组成和杀虫蛋白基因型进行鉴定,主要结果如下:   1采用芽孢杆菌选择性培养基与晶体染色相结合的方法,从山东省17个地区120份土样中分离出Bt菌株9株,Bt菌株的平均分出率为7.5%。这些Bt菌株的晶体主要形态包括菱形、圆形和方形等形状。   2以美国白蛾3龄幼虫为试虫,通过生物测定对本试验分离的9株Bt和实验室保存的113株(共计122株)Bt进行高毒力菌株筛选,当菌液浓度为1mg/mL时,对美国白蛾3龄幼虫校正死亡率高于80%的菌株有30株;当稀释至浓度为0.1mg/mL进一步筛选时,得到校正死亡率高于60%的菌株有16株。其中高毒力菌株B-WRC-1和HD-1的LC50分别为0.009707mg/mL和0.010187mg/mL。   3采用SDS-PAGE方法对16株Bt的杀虫晶体蛋白进行分析,结果表明,有11株Bt菌株中同时含有130kDa和60或70kDa的蛋白,1株同时含有130和140kDa的蛋白,3株只含有130kDa的蛋白,1株含有30kDa的蛋白。   4采用PCR-RFLP方法对16株Bt的杀虫蛋白基因类型进行鉴定,结果表明,有14株Bt同时含有cry1和cry2类杀虫蛋白基因,其中4株还包括cry9类基因,2株Bt中没有鉴定到已知基因类型,可能含有新的杀虫基因。16株Bt菌株均不含cry3和cry8类基因。
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