免疫炎症反应是冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary heart disease, CHD)发生发展的重要病理生理机制。C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)是目前使用最广泛的炎症标志物之一,并被一致认为是CHD一个重要的风险预测指标。然而,关于CRP与CHD之间的因果关联,目前国际上却存在很大的争议。树突状细胞(Dendritic cells, DCs)启动并调控机体的免疫炎症反应,构成CHD炎症机制的中心环节。在我们前期研究中,已发现氧化低密度脂蛋白和糖基化终末产物等CHD危险因素能激活DCs免疫炎症反应,同时,也关注到一些抑制CHD进展的物质或药物能减轻DCs免疫炎症。文献报道,DCs表达CRP受体——CD32,提示CRP对DCs具有一定的调节功能。但是,关于CRP是启动还是抑制DCs免疫炎症,国际上存在完全相反的报道；而关于CRP调控DCs的分子机制,也极少有文献报道。鉴于DCs在CHD慢性炎症机制中的重要地位以及文献报道CRP对DCs免疫炎症调控作用的分歧,尤其是CRP与CHD之间因果关联的广泛争议,我们开展了本研究,探讨CRP调控DCs的免疫功能及其分子机制,为进一步阐明CRP与CHD的因果关联提供证据。第一部分C反应蛋白对树突状细胞免疫表型与功能的调控作用目的：探讨CRP对DCs免疫表型、细胞因子分泌、以及刺激T细胞增殖等功能的影响。方法：(1)采用免疫磁珠分选CD14+单核细胞,经细胞因子诱导分化为人外周血单核源性树突状细胞(monocyte-derived dendritic cells, MoDC);(2)分组：未干预组、不同浓度CRP (5,15,3μg/mL)组和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS,100ng/mL)阳性对照组,在48小时分别收集细胞与上清；(3)流式细胞技术检测MoDC免疫表型；(4)定量PCR结合ELISA方法检测IL-12、IL-10、TNF-a和IL-6炎症细胞因子；(5)免疫磁珠方法分选CD4+CD45RA+T细胞,分别将经CRP (30μg/mL)和LPS (100ng/mL)诱导48小时的MoDC与T细胞按照1：5、1：10和1：20比例进行混合培养,采用同种异体混合T细胞增殖实验来检测CRP和LPS对T细胞增殖的影响。结果：(1) MoDC经形态学鉴定,培养成功；(2)流式细胞检测结果表明,CRP(15和30ng/mL)上调CD80和CD86(p<0.05),而对其他的免疫表型分子(CD83、 CD40和MHC-II)作用并不明显(p>0.05), LPS显著上调CD80、CD86、CD83、 CD40和CDla的表达(p<0.05)；(3)定量PCR和ELISA结果一致表明,CRP(30μg/mL)对IL.12的表达无明显促进作用(p>0.05),对IL-10的表达有下降趋势(p>0.05);(4)CRP显著下调TNF-α mRNA的表达(p<0.05),对IL-6mRNA表达无明显作用(p>0.05)；而LPS显著上调细胞因子IL-12、IL-10、TNF-α和IL-6的表达(p<0.05);(5) CRP不能促进T细胞增殖,反而有一定的抑制趋势(p>0.05), LPS显著促进T细胞增殖反应(p<0.05),其中以DC：T=I：10作用最强。结论：(1)LPS促进DCs成熟,并激活T细胞反应,这与以往文献报道一致,表明实验体系稳定。(2)CRP部分上调免疫表型分子,但并不上调炎症因子分泌,也不能促进T细胞增殖。有理由认为,CRP诱导DCs呈半成熟状态,从而发挥负向免疫调控和维持免疫稳态的作用。第二部分CRP与LPS刺激DCs的全基因组表达谱芯片检测与分析目的：探讨CRP与LPS两者调控DCs免疫功能及其分子机制之间的异同。方法：(1)培养MoDC(来自3名健康男性献血者),分为对照组、CRP(30μg/mL)组和LPS (100ng/mL)组,在48小时收集细胞,抽提RNA,采用Affymetrix affymetrix u133plus2.0表达谱芯片检测其全基因组表达水平；(2)采用TwoClassDif方法进行差异基因筛选；(3)采用在线MAS2.0软件进行基因功能(GO/Biological function)与信号转导通路(PATHWAY/KEGG)分子注释分析；(4)基于CRP诱导DCs的差异表达基因,构建信号转导网络(Signal-Net)。结果：(1)RNA质检符合芯片要求；(2)CRP与对照组的差异基因有815个,其中CRP特异诱导的差异基因为613个(432个上调/181个下调)；LPS与对照组差异基因1477个,其中LPS特异诱导的差异基因为1303个(804个上调/499个下调)。此外,有少数差异基因为CRP与LPS所共有；(3)CRP特异下调的差异基因中,与DCs免疫功能密切相关的显著性GO主要包括：炎症反应和趋化；所参与的显著性：PATHWAY主要有：TOLL样受体信号途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用和细胞黏附分子信号途径等；(4)LPS特异上调的差异基因中,与DCs免疫功能密切相关的显著性GO主要有：正调控NF-KB途径、正调控IL-2合成与IL-4合成、正调控IL-6合成以及对Y-干扰素(IFN-γ)的反应等；所参与的显著性PATHWAY主要有：TOLL受体信号途径、细胞因子-细胞因子受体以及细胞黏附分子信号途径、B细胞受体信号途径和T细胞受体信号途径等；(5)CRP差异基因分子注释中,存在一些与脂代谢密切相关的基因所组成的显著性GO如：脂蛋白代谢和胆固醇合成、以及PATHWAY如：短链脂肪酸代谢途径、脂联素细胞因子信号途径和PPAR-γ信号途径等。(6) Signal-Net图中所筛查到的基因主要有两大类,一类为趋化因子和受体及其相关的转录因子,其表达均显著下调,包括CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、 CCL7(MCP-3)、CXCL1-CXCL3、CX3CR1以及转录因子——活化T细胞核因子1等；另一类为调控细胞周期并与细胞凋亡相关的基因,如CDKN1B(p27.kipl)、 CCND1、CCND2、CCNE2以及PTEN和FOXO1等。结论：高通量数据筛选结果揭示,(1)与LPS诱导DCs成熟和启动免疫炎症反应相反,CRP抑制DCs免疫炎症相关基因的表达,包括炎症细胞因子的合成以及趋化因子及其受体的表达；(2)CRP可能具有独立于LPS的调控DCs参与脂代谢的作用；(3)CRP可能通过改变与细胞凋亡密切相关的基因的表达而影响DCs的寿命。第三部分C反应蛋白调控树突状细胞维持免疫稳态的分子机制的初步研究目的：验证并检测Signal-Net图中CRP对DCs表达凋亡相关基因如PTEN、 FOXO1和CDKN1B(p27.kipl)的影响,探讨CRP调控DCs以维持免疫稳态的分子机制。方法：(1)培养MoDC,干预和分组同第二部分；(2)定量PCR验证CRP和LPS对MoDC表达PTEN,FOXO1和CDKN1B(p27.kipl)的影响；(3)WesternBlot检测CRP和LPS对MoDC表达上述蛋2的作用,并检测Caspase-7和PARP的表达；(4)采用流式细胞技术分析CRP和LPS对MoDC凋亡的影响。结果：(1)定量PCR和Western Blot结果均显示,CRP显著诱导PTEN和CDKN1B(p27.kipl)表达上调,对FOXO1也有一定上调作用；而LPS诱导FOXO1显著上调,对CDKN1B(p27.kipl)表达也有上调趋势；(2) Western Blot结果表明,CRP和LPS均上调Caspase-7和PARP的表达,并显著增加其裂解产物；(3)CRP和LPS均能够诱导MoDC发生凋亡。结论：(1)CRP上调PTEN、FOXO1和CDKN1B(p27.kipl)的表达,其结果与芯片检测结果一致；(2)CRP可能通过上调PTEN、FOXO1和CDKN1B(p27.kipl)的表达,激活Caspase-7并裂解PARP,以诱导DCs凋亡,从而负向调控DCs免疫炎症并维持DCs免疫稳态。全文总结1、与LPS诱导DCs成熟并启动免疫炎症相反,CRP诱导smDC形成,抑制DCs免疫炎症相关基因,包括下调CC型和CXC型趋化因子的表达,从而负向调控DCs免疫炎症。2、CRP上调抑癌基因PTEN、FOXO1和CDKN1B(p27.kipl)表达,激活Caspase-7并裂解PARP,以诱导DCs凋亡,从而维持DCs免疫稳态。潜在价值和创新点1、发现CRP诱导smDC形成,初步证明CRP抑制DCs免疫炎症相关基因表达,包括诱导CC型和CXC型趋化因子表达下调,从而负向调控DCs免疫炎症；2、初步揭示CRP通过上调抑癌基因PTEN、FOXO1和CDKN1B(p27.kipl)表达,激活Caspase-7并裂解PARP,从而诱导DCs凋亡,以维持DCs免疫稳态；3、本实验结果丰富了对DCs免疫炎症调控机制的认识,为今后深入研究DCs负向免疫的调控机制及其在CHD中的作用开辟了新思路。