目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是继肿瘤、心血管疾病之后第三大非传染性慢性疾病,严重威胁着人类健康。目前,全球已有3.82亿人患有DM,预计到2035年将达到5.92亿。我国目前DM患者已经达到9840万,约占全球患病人数的四分之一。据统计,近三分之一的DM患者伴有糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)。DN是引起终末肾病的主要原因,也是DM患者的主要死亡原因。到目前为止,DN发生的内在机制尚未完全阐明,更无特效治疗手段。因此,对DN发病及治疗机制的研究迫切而意义重大。DN时,肾小球基底膜增厚、系膜细胞分泌的细胞外基质成分积聚,继而引起肾小球硬化。DN时,肾小球系膜细胞产生的细胞外基质主要是Ⅳ型胶原。Ⅳ型胶原分子有6条同源性α链:α1(Ⅳ>α6(Ⅳ),分别由不同基因编码。DN纤维化的发生发展主要依靠转化生长因子-β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)途径所调节。TGF-β1主要通过转录因子Smad3传递信号,启动肾小球基质的主要成份Ⅳ型胶原基因转录。我们的前期试验已证明,高糖刺激的早期反应通过激活TGF-β1/Smad3信号通路,最终导致Ⅳ型胶原各α链基因的大量表达。C肽由Steiner等人于20世纪60年代研究胰岛素合成时首次被描述,主要在脊椎动物胰腺的胰岛β细胞中产生。它是连接胰岛素原分子中胰岛素A链与B链的一种连接肽。人C肽由31个氨基酸残基组成,其分子量为3020Da,等电点为3.0,半衰期为30min,主要经肾脏代谢。正常人血清C肽的基础水平约为0.4 nmol/L。近年来发现C肽有多种生物学作用,对DM并发症,特别是DN有明显治疗作用。Sun等的研究表明,C肽可改善DM大鼠肾小球基底膜和系膜的扩增。临床上也发现Ⅰ型DM患者做胰腺移植或胰岛素-C肽联合应用后,肾脏病变减轻。C肽作为内源性因子,治疗DN疗效独特,具有其它外源性药物无可比拟的优势,更突显了明确其作用机制的必要性和迫切性。DM时,Ⅳ型胶原积聚是DN的直接原因。而C肽能逆转DN的肾脏病变,提示C肽作用机制与调控Ⅳ型胶原代谢紧密相关。虽有研究表明,在DM大鼠模型体内,C肽能通过抑制DM大鼠肾小球系膜Ⅳ型胶原的形成来抑制其肾小球系膜扩增,但其内在分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨C肽是否通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路抑制Ⅳ型胶原基因的表达,达到逆转DN纤维化的功效。本实验采用大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1,首先应用不同高糖来寻找模拟糖尿病高糖状态的最佳高糖浓度;其次应用该最佳高糖浓度作用不同时间来寻找高糖的最佳起效时间;然后应用不同浓度C肽在同一高糖浓度及相同作用时间寻找C肽的有效浓度;用实时定量-PCR法(realtime-PCR)检测 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、αα5(Ⅳ)以及 TGF-β1 mRNA水平变化,同时利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)来检测细胞液中TGF-β1蛋白水平变化。用免疫荧光染色法观察Smad3核转位;利用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技术,检测 Smad3 与 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)启动子的相互作用。据此,探讨C肽逆转DN纤维化的主要分子机制,为治疗DN提供实验依据。本实验还采用健康雄性SD大鼠进行动物实验,用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)造DM模型,C肽进行干预治疗,实验前后测定血糖、体重变化,测定24小时尿蛋白含量,并取大鼠肾皮质于光镜及透射电镜下进行形态学观察,旨在进一步探讨C肽逆转DN的整体功效及作用。方法:1细胞培养:大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1,购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。HBZY-1细胞用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基培养,0.25%胰蛋白酶消化传代,接种于150ml培养瓶中,在37℃、5%CO2培养箱中培养。用C肽或乱码C肽处理HBZY-1细胞,先用高糖DMEM培养24小时后,再换成C肽+高糖DMEM培养。2细胞实验设计与分组:2.1 探讨不同糖浓度 DMEM 对 HBZY-1 中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和TGF-β1基因表达以及细胞液中TGF-β1的蛋白含量的影响用不同糖浓度DMEM培养HBZY-1 24小时,根据不同糖浓度的DMEM分为6组:Con组(正常对照,细胞用低糖-DMEM培养)、20mM组(细胞用含20mmol/L的葡萄糖-DMEM培养)、25mM组(细胞用含25mmol/L的葡萄糖-DMEM培养)、30mM组(细胞用含30mmol/L的葡萄糖-DMEM培养)、35mM组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培养)以及40mM组(细胞用含40mmol/L的葡萄糖-DMEM培养)。2.2 探讨 35mmol/L高糖 DMEM对HBZY-1 细胞中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和TGF-β1基因表达以及细胞液中TGF-β1的蛋白含量的影响用35mmol/L高糖DMEM培养HBZY-1细胞,根据高糖作用时间不同分为4组:Con组(正常对照,细胞用低糖-DMEM培养)、3h组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培养3小时)、6h组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培养6小时)、12h组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培养12小时)。2.3 探讨不同浓度 C 肽对 HBZY-1 细胞中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和TGF-β1 mRNA表达以及细胞液中TGF-β1的蛋白含量的影响根据C肽浓度不同分为6组:Con组(正常对照,细胞用低糖-DMEM培养)、OC组(高渗对照组,细胞用含35mmol/LL构型葡萄糖-DMEM培养)、HG组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培养)、CP1组(0.1nmol/L C 肽+35mmol/L 高糖组)、CP5 组(0.5nmol/L C 肽+35mmol/L 高糖组)和 CP9组(0.9nmol/LC 肽+35mmol/L 高糖组)。2.4探讨HBZY-1细胞中Smad3的核转位情况根据培养条件不同分为7组:Con组(正常对照,细胞用低糖-DMEM培养)、HG1组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培养1小时)、HG2组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培养2小时)、HG3组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培养3小时)、CP1组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM+0.5nmol/LC肽培养1小时)、CP2组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM+0.5nmol/LC肽培养2小时)和CP3组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM+0.5nmol/LC肽培养3小时)。2.5 探讨转录因子 Smad3 与 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)或 α5(Ⅳ)启动子的相互作用实验分成5组:Con组(正常对照,细胞用低糖-DMEM培养)、OC组(高渗对照组,细胞用含35mmol/L L构型葡萄糖-DMEM培养)、HG组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培养)、CP组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM+0.5nmol/LC肽培养)、ScCP组(细胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM+0.5nmol/L乱码C肽培养)。3 HBZY-1 细胞中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和 TGF-β1 mRNA表达水平的检测Trizol 一步法分别提取HBZY-1细胞中总RNA;用β-actin做内参,real-time PCR 方法检测 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)及 TGF-β1的mRNA表达。4利用免疫荧光法,检测HBZY-1细胞中Smad3的核转位情况5 利用 ChIP 技术,检测 HBZY-1 细胞中,Smad3 与 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)或α5(Ⅳ)启动子的相互作用6动物分组与取材健康雄性SD大鼠80只,随机分为2组,正常组(Con)8只,其余72只腹腔注射STZ溶液(STZ溶于浓度为0.1 mol/L的柠檬酸纳缓冲液,pH 4.4,新鲜配制,终浓度为10mg/mL,按45mg/kg腹腔注射)制备DM模型。注射3天后,测空腹血糖高于16.7mmol/L,尿糖+++以上,为造模成功。造模成功68只,再将其随机分成4组:病理组(DM,17只),C肽防治组,C肽治疗组(CP,17只),乱码C肽治疗组(ScCP,17只)。以上五组均20～25℃室温下喂养。DP组每天两次皮下注射C肽(130nmol/kg),治疗6周后停药。CP组和ScCP组在病程6周后,分别开始每天两次皮下注射人C肽或乱码C肽(130nmol/kg),治疗6周。最后股动脉放血处死。6.1检测血糖和24小时尿白蛋白含量取尾静脉血,用血糖仪检测并记录注射STZ前、后第3天和第12周的血糖变化。收集24小时尿液,检测尿白蛋白含量。6.2形态学观察取肾皮质作病理切片,分别于光镜和透射电镜下观察。结果:1 realtime-PCR 检测不同糖浓度 DMEM 对 HBZY-1 中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和 TGF-β1mRNA 表达1.1 α1(Ⅳ)mRNA的相对表达量与Con组比20mM组(2.25 ± 0.12,P<0.05)、25mM 组(2.69 ±0.19,P<0.01)、30mM 组(2.51±0.10,P<0.01)、35mM 组(4.02 ± 0.52,P<0.01)以及 40mM 组(3.20 ± 0.36,P<0.01)均显著升高。1.2 α2(Ⅳ)mRNA的相对表达量与Con组比20mM组(2.98 ± 0.22,P<0.01)、25mM 组(2.57 ±0.38,P<0.05)、30mM 组(2.57 ± 0.30,P<0.05)、35mmol/L 组(4.28 ±0.54,P<0.01)以及 40mM 组(2.40 ± 0.32,P<0.05)均显著升高。1.3 α3(Ⅳ)mRNA的相对表达量与Con组比20mM组(2.42 ± 0.10,P<0.05)、25mM 组(2.54 ±0.29,P<0.01)、30mM 组(2.58 ±0.27,P<0.01)、35mM 组(3.84 ± 0.32,P<0.01)以及 40mM 组(2.59 ± 0.40,P<0.01)均显著升高。1.4 α4(Ⅳ)mRNA的相对表达量与Con组比20mM组(3.33 ± 0.16,P<0.01)、25mM 组(3.39 ±0.25,P<0.01)、30mM 组(3.32 ±0.44,P<0.01)、35mM 组(4.68 ± 0.44,P<0.01)以及 40mM 组(3.50 ± 0.22,P<0.01)均显著升高。1.5 α5(Ⅳ)mRNA的相对表达量与Con组比20mM组(2.13 ± 0.15,P<0.01)、25mM 组(2.31 ±0.09,P 0.01)、30mM 组(2.17 ±0.05,P<0.01)、35mM 组(3.39 ± 0.05,P<0.01)以及 40mM 组(2.192 ± 0.09,P<0.01)均显著升高。1.6 TGF-β1 mRNA的相对表达量与Con组比20mM组(3.10 ± 0.29,P<0.01)、25mM组(3.14±0.14,P<0.01)、30mM组(2.78±0.32,P<0.01)、35mM 组(3.76 ± 0.27,P<0.01)以及 40mM 组(2.84 ± 0.14,P<0.01)均显著升高。2realtime-PCR检测不同时间点35mmol/L高糖DMEM对HBZY-1细胞中α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和 TGF-β1mRNA 表达的影响2.1 α1(Ⅳ)mRNA 的相对表达量与 Con 组比 3h 组(4.63 ± 0.61,P<0.01)、6h 组(2.48 ± 0.26,P<0.05)、12h 组(2.86 ± 0.17,P<0.01)均显著升高。2.2 α2(Ⅳ)mRNA 的相对表达量与 Con 组比 3h 组(2.97 ± 0.05,P<0.05)、6h 组(2.43 ± 0.13,P<0.01)、12h 组(2.66 ± 0.12,P<0.01)均显著升高。2.3 α3(Ⅳ)mRNA 的相对表达量与 Con 组比 3h 组(4.00 ± 0.56,P ＜ 0.01)、6h 组(3.05 ± 0.49,P<0.01)、12h 组(3.07 ± 0.50,P<0.01)均显著升高。2.4 α4(Ⅳ)mRNA 的相对表达量与 Con 组比 3h 组(2.94 ± 0.82,P<0.01)、6h 组(2.13 ± 0.07,P<0.01)、12h 组(2.44 ± 0.07,P<0.01)均显著升高。2.5 HBZY-1中α5(Ⅳ)mRNA的相对表达量与(Con组比3h组(3.41±0.16,P<0.01)、6h组(2.40±0.11,P<0.01)、12h组(2.42±0.06,P<0.01)均显著升高。2.6 TGF-β1 mRNA 的相对表达量与 Con 组比 3h 组(4.00 ± 0.56,P<0.01)、6h 组(3.05 ± 0.49,P<0.05)、12h 组(3.07 ± 0.50,P<0.05)均显著升高。3 realtime-PCR 检测不同浓度 C 肽对 HBZY-1 细胞中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和 TGF-β1mRNA 表达的影响3.1 α1(Ⅳ)mRNA的相对表达量与Con组比OC组(1.16 ± 0.11)、CP5组(1.18 ± 0.16)无统计学差异;而与Con组比HG组(3.59 ± 0.57,P<0.01)、CP1 组(3.59±0.57,P<0.01)、CP9组(3.82±0.55,P<0.01)均显著升高。3.2 α2(Ⅳ)mRNA 的相对表达量与 Con 组比 OC 组(0.96 ± 0.10)、CP5(0.92±0.12)无统计学差异;而与Con组比HG组(3.12 ±0.48,P<0.01)、CP1组(2.53 ± 0.28,P<0.01)、CP9 组(2.25 ± 0.28,P<0.05)均显著升高。3.3 α3(Ⅳ)mRNA的相对表达量与Con组比OC组(0.85 ± 0.07)、CP5组(1.04 ± 0.13)无统计学差异;而与Con组比HG组(2.67 ± 0.45,P<0.05)、CP1 组(2.46 ± 0.52,P<0.05)、CP9 组(2.42 ± 0.40,P<0.05)均显著升高。3.4 α4(Ⅳ)mRNA的相对表达量与Con组比OC组(1.10 ± 0.12)、CP5组(1.12 ± 0.10)无统计学差异;而与 Con 组比 HG 组(2.18 ± 0.18,P<0.01)、CP1 组(2.22 ± 0.15,P<0.01)、CP9 组(2.26 ± 0.15,P<0.01)均显著升高。3.5 α5(Ⅳ)mRNA的相对表达量与Con组比OC组(1.05 ± 0.06)、CP5组(1.08 ± 0.07)无统计学差异;而与Con组比HG组(2.30 ± 0.07,P<0.01)、CP1 组(1.71 ± 0.05,P<0.01)、CP9 组(2.04 ± 0.11,P<0.01)均显著升高。3.6 TGF-β1 mRNA的相对表达量与Con组比OC组(1.04 ± 0.07)、CP5组(1.06 ± 0.14)无统计学差异;而与Con组比HG组(2.90 ± 0.09,P<0.01)、CP1 组(2.04 ± 0.13,P<0.01)、CP9 组(2.21 ± 0.21,P<0.01)均显著升高。4 ELISA检测不同糖浓度DMEM对HBZY-1细胞液中TGF-β1蛋白含量的影响。与 Con 组(506.60 ± 37.44 pg/ml)比 20mM 组(485.55 ± 12.49 pg/ml)无统计学差异;而 25mM 组(364.12 ± 18.12 pg/ml,P ＜ 0.01)、30mM 组(385.25 ± 20.42 pg/ml,P ＜ 0.01)、35mM 组(307.29 ± 6.66 pg/ml,P ＜ 0.01)以及 40mM 组(352.22±14.98 pg/ml,P＜0.01)均显著降低。5 ELISA检测35mmol/L高糖DMEM,不同时间点对HBZY-1细胞液中TGF-β1 蛋白含量的影响。与 Con 组(798.972± 37.367pg/ml)比 3h 组(322.77± 22.52 pg/ml,P ＜ 0.01)、6h 组(447.69 ± 47.68 pg/ml,P ＜ 0.01)均显著降低;而12h组(738.40 ± 64.53 pg/ml)却无统计学差异。6 ELISA检测不同浓度C肽对细胞液中TGF-β1蛋白含量的影响。与Con组(1228.90 ± 57.79 pg/ml)比 OC 组(1198.99 ± 26.14 pg/ml)、CP5 组(1197.19± 13.75 pg/ml)无统计学差异;而 HG 组(1036.07 ± 55.64 pg/ml,P ＜ 0.05)、CP1 组(1365.66 ± 45.84 pg/ml,P ＜ 0.05)以及 CP9 组(1459.49 ± 45.52 pg/ml,P<0.05)均有统计学差异。7免疫荧光法检测HBZY-1细胞核中Smad3的核转位情况。正常组细胞在3h内均未检测到Smad3荧光;HG1组及HG2组检测到部分Smad3荧光;HG3组Smad3荧光强度最为显著,Smad3蛋白几乎全都进核。CP1组和CP2组检测到Smad3荧光;CP3组Smad3荧光最弱,Smad3蛋白几乎都已出核。8 ChIP 技术检测 HBZY-1 细胞内 Smad3 与 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)或α5(Ⅳ)各启动子的相互作用的变化。8.1与Con组比Smad3与α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)启动子区的结合作用OC组(1.08± 0.11)、CP 组(1.18 ± 0.11)均无统计学差异;而 HG 组(2.58 ± 0.21,P<0.01)、ScCP 组(2.04 ± 0.12,P ＜ 0.01)均显著升高。8.2与Con组比Smad3与α3(Ⅳ)及α4(Ⅳ)启动子区的结合作用OC组(1.16± 0.06)、CP 组(1.41 ± 0.26)均无统计学差异;而 HG 组(109.33 ± 2.85,P<0.01)、ScCP 组(66.09 ± 6.51,P<0.01)均显著升高。8.3与Con组比Smad3与α5(Ⅳ)启动子区的结合作用OC组(1.23 ± 0.17)、CP 组(1.59 ± 0.15)均无统计学差异;而 HG 组(13.08 ± 0.83,P<0.05)、ScCP组(10.26 ± 0.90,P<0.05)均显著升高。9大鼠的一般表现以及C肽对DM大鼠血糖和体重的影响造模成功的大鼠逐渐出现消瘦,皮毛无光泽、疏松,反应迟钝,多饮、多尿、多食、生长迟缓等症状。随着实验进行,DM组和ScCP组体征更加明显,而DP组和CP组明显有好转。各组大鼠入选时血糖和体重无显著性差异。整个实验中,DP组平均血糖(29.96±0.52mmol/L),CP组(28.9±0.74mmol/L),ScCP组(29.74±0.66mmol/L),均与DM组(29.23 ± 0.66mmol/L)无显著性差异。以上四组均显著高于 Con 组(6.4 ± 0.25 mmol/L,P<0.01)。药物干预治疗结束时,CP组体重(271.82 ±8.76 g),ScCP组(248.35 ±7.19 g),DP 组体重(368.06 ±10.09 g),均与 DM 组(249.00 ±7.13 g)无显著性差异。以上四组均显著低于Con组(515.50 ± 14.42 g,P<0.01)。10尿白蛋白含量的变化整个实验中,DP 组(55.21 ± 4.06 mg)及 CP 组(70.2 ± 9.46 mg)平均 24小时尿白蛋白含量均显著低于DM组(327.93 ± 32.58 mg,P<0.05);ScCP组(293.79 ± 49.40 mg)平均24小时尿白蛋白含量与DM组无显著性差异。以上四组均显著高于Con组(15.42 ± 4.06 mg,P＜ 0.01)。11肾小球形态学观察肾小球光镜(×400)下观察:Con组肾小球未见异常;DM组,可见肾小球结构异常、肾小囊腔增大;ScCP组与DM组相似,并且有肾小球坏死的现象;而DP组和CP组,可见肾小囊腔缩小,与DM组比有所改善,且DP组较CP组的病理改变减轻。肾小球透射电镜(×20K)下观察:Con肾小球未见异常。DM组,可见基底膜重度增厚,呈丘状隆起,足突重度融合,血管内皮细胞重度增生,窗孔加减少;ScCP组与DM组相似;DP组和CP组可见基底膜和血管内皮细胞接近正常,足突部分轻度融合,与DM组比明显改善,且DP组较CP组的病理改变减轻。结论:1 C肽调控Ⅳ型胶原表达逆转糖尿病肾病纤维化的分子机制是:(1)C肽可明显抑制高糖(35mmol/L)引起的系膜细胞Ⅳ型胶原各α链以及TGF-β1过表达,其抑制强度以0.5nmol/LC肽浓度最为显著,且该抑制作用不随C肽浓度增大而增强。(2)C肽通过抑制转录因子Smad3与Ⅳ型胶原各α链启动子相互作用抑制Ⅳ型胶原各α链基因的表达。2 C肽能改善DM大鼠肾小球的形态学变化。