研究背景胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,发展中国家特别是中国是高发地区。胃癌死亡率在所有恶性肿瘤中较高,是最常见的威胁人类健康的恶性疾病之一。胃癌的高危因素有家族性遗传因素、不良饮食生活习惯、胃部良性病变、幽门螺杆菌感染和长期吸烟等。胃癌的组织学类型以腺癌常见,病理类型可分为早期胃癌和进展期胃癌。胃癌早期常缺乏典型的临床症状,故难以早期发现,当患者出现明显疼痛,或伴有梗阻、出血等并发症以及可触及腹部肿物、锁骨上及腋窝淋巴结肿大、直肠陷窝肿物、脐部肿物,甚至合并腹水、黄疸、卵巢肿大、呼吸困难等肿瘤转移情况而就医时,多数已进展为晚期。胃癌的诊断主要依靠辅助检查及实验室检查。辅助检查主要为腹部超声、X线钡餐、CT、纤维胃镜以及超声内镜等,对于判定肿瘤的生长位置、大小、临床分型分期、与周围组织器官的关系,决定手术方法及手术方式等方面有重要参考价值。实验室检查方式如胃液检查、大便隐血检查、血生化检查等,对于判断病人的总体情况有帮助。另外,目前胃癌临床常检测的肿瘤标志物有CEA、CA19-9,CA72-4等,还有CA50、CA19-5、CA24-2、CYFRA2H、p53基因、Ki-67、EGFR、MMPs、 TIMPs、COX-2及CD133等多种肿瘤标志物和基因可用于辅助胃癌诊断及判断胃癌术后情况,但由于单个检测因子缺乏较高的敏感性与特异性,故目前仍然以多标志物联合检测为主,以提高胃癌的诊断率。胃癌目前仍然以手术治疗为主,早期胃癌的手术效果较好,5年生存率可达90%以上,但是由于早期胃癌难以发现,故一般胃癌手术病人多数为进展期,手术切除效果不佳,故如果能提高胃癌的早期诊断率对于提高患者的生存率具有极其重要的作用。某些胃癌高发的发达国家如日本采用多种技术手段对胃癌进行大范围的人口普查,胃癌的早期诊断率达到45%-55%,但是我国的早期胃癌诊断率却不足10%。基因诊断和基因治疗是目前医学界研究的热点和重点。从人体中筛选出对胃癌有决定性作用的基因从而进行胃癌的早期筛选和早期诊断更是研究重点。胃癌除手术外,还有放疗、化疗等治疗手段,但放化疗对于人体肿瘤细胞和正常细胞不能明确区分,造成人体伤害较大,基因治疗可避免对正常细胞的伤害,故寻找胃癌基因治疗的新靶点进行基因治疗亦是目前研究重点。NOB1(nin one binding)基因是通过同源序列标签技术在2005年克隆得到的一个新的核蛋白基因,研究确定该基因是酵母基因Noblp的人类同源基因,人类NOB1基因包含9个外显子和8个内含子序列,由位于N端的PIN(PilT aminoterminus)和C端的ZNRD1(zinc ribbon domain containing1)结构域共同组成。ZNRD1的基础研究证明它有对基因转录起重要作用的功能性结构域,在多种恶性肿瘤的癌变基因的信号通路传导中起重要作用,并与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。NOB1中的PIN结构域具有RNA酶活性,直接参与核糖体40S小亚基的形成过程,故与核糖体的组装合成密切相关,从而影响到rRNA新陈代谢及蛋白质的合成过程。NOB1与真核细胞体内的高选择性、高效能的泛素-蛋白降解途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)密切相关,NOB1作为分子伴侣,直接参与UPP中最重要的26S蛋白酶体的形成过程。UPP可降解癌基因、抑癌基因产物以及变性变构蛋白等,维持细胞正常功能,也可通过水解p53和CDKs等蛋白分子,调控细胞周期素和细胞周期素依赖性蛋白激酶等方式,参与细胞周期的调控。若NOB1缺乏,可因UPP的功能异常引起肿瘤的发生。另外,已有多项研究表明,NOB1的表达水平与多种恶性肿瘤的发生发展存在密切的联系,在某些恶性肿瘤中还与它们的临床病理特征存在一定的联系。研究目的NOB1基因从现有的临床研究中,发现其与很多恶性肿瘤的发生发展、肿瘤细胞的增殖与调控过程以及肿瘤细胞的凋亡消除过程等密切相关,所以本课题通过对NOB1基因在胃癌组织及毗邻癌旁正常组织中的表达差异进行研究,对NOB1的表达与胃癌患者的临床病理特征关系进行分析,从而对NOB1基因在胃癌发生发展中的作用机制和关系作出探讨,继而探讨NOB1基因能否成为胃癌新的基因诊断和基因治疗的靶点,为胃癌病人的治疗提供一条新的途径。实验材料与方法1、实验材料：选取30例医院手术切除且病理资料完整的胃癌组织标本及其相应癌旁正常组织标本(距癌组织大于5.0cm),其中男22例,女8例,平均年龄56.03岁(25～76岁)。病理分级采用AJCC(2009)分类法,根据分化程度不同分为高、中、低三级。所有患者术前均未接受放疗、化疗和/或免疫治疗。2、利用免疫组织化学法(IHC)检测胃癌组织与癌旁正常组织中NOB1蛋白的表达情况。常规石蜡包埋组织块,石蜡组织块进行切片和进行HE染色,然后根据SP免疫组化染色试剂盒内说明书进行实验操作,阳性对照利用已知的阳性切片,阴性对照利用PBS替代一抗进行。数据分析：用半定量免疫评分法,根据阳性细胞染色强度和染色比例两方面分数的乘积得分作为评判标准。.阳性细胞染色强度：采用双盲法评估染色结果,IHC的染色结果为胞浆或胞核内不显色或呈现淡黄色、棕黄色、棕褐色颗粒,四种类型染色强度分别标记为0、1、2、3分。阳性细胞染色比例：每个标本切片在高倍显微镜(x400倍)下随机选取5个较有代表性的观测视野,然后在5个选取的观测视野内随机选取200个细胞进行统计计数,计数的细胞总数不能少于1000个。阳性细胞计数<25%、26%-50%、51‰～75%、76%-100%分别标记为1、2、3、4分。乘积得分判定分为四个等级：0～2分为(-),3-5分为(+),6-8分为(++),>8分为(+++)。得分为3-5分(+)及以上为表达阳性。3、利用实时定量PCR法(Real-time PCR)检测胃癌组织与癌旁正常组织中NoB1mRNA的表达情况。NOB1上游引物为5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3’,下游引物为5’-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’。 GAPDH基因为内参,上游引物为5’-CCCTCTCACGCAGCCAACAT-3’,下游引物为5’-CGTATTCCGGTA AGGGCTCC-3’。用Trizol法进行总RNA的提取。按照TAKARA说明书配制逆转录反应体系,合成cDNA第一链。对Mg2+、引物等浓度进行优化。进行Real-time PCR扩增的反应体系为25g1,按照95℃2min,95℃30s,60℃30s,72-C30s,40循环。采用实时定量PCR仪检测NOB1的mRNA表达改变,反应结束后,读取原始Ct值,用2-△△Ct法分析NOB1基因相对表达量。4、根据NOB1表达情况与胃癌患者的临床病理特征进行分析。5、统计学方法：应用SPSS13.0软件对结果进行统计学分析。Real-time PCR实验数据以x±s表示,两组间比较采用t检验,免疫组化阳性率之间比较用X2检验,临床病理特征关系分析用fisher确切概率法,P<0.05为差异有统计学意义。实验结果1、免疫组化法检测结果显示,胃癌组织与癌旁正常组织NOB1蛋白在胞浆及胞核中均呈弥漫性表达。癌旁正常组织中,16例为(-),8例为(+),3例为(++),3例为(+++),阳性表达率为47%。胃癌组织中,8例为(-),7例为(+),8例为(++),7例为(+++),阳性表达率为73%,明显高于癌旁正常组织中的阳性表达率(X2=4.444,P<0.05)。2、实时定量PCR法检测结果显示,内参NAPDH基因与NOB1的扩增均可见标准的S形扩增曲线和单峰溶解曲线,说明扩增产物的特异性好,实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰。采用2--ct法分析NOB1基因相对表达量,实验结果是经过内参基因表达水平校准的实验组样本中目标基因相对于对照组样本的增加或减少的倍数。检测中发现30例胃癌组织NOB1mRNA相对表达量2-△△Ct值为4.899±1.412(x±s),与癌旁正常组织相对表达量1相比,差异有统计学意义(P<0.01)。3、在进行NOB1表达情况与胃癌患者的临床病理特征关系的分析比较中发现,NOB1的表达情况与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、浸润程度、淋巴结转移情况、远处转移情况、pTNM分期无明显关系(均P>0.05),而与肿瘤直径也即肿瘤大小有明显关系(P<0.05)。实验结论1、两种方法的检测结果提示,NOB1基因的mRNA和蛋白表达量在胃癌组织中均高于癌旁正常组织,提示NOB1基因可能是胃癌基因诊断和治疗的靶点之一。2、NOB1蛋白表达与肿瘤大小有关,而与年龄、性别、分化程度、淋巴结转移、远处转移、pTNM分期等无关,提示NOB1蛋白表达量可能随肿瘤的生长而增长。3、NOB1在胃癌中表达升高,提示NOB1可能在胃癌的发生发展过程中起重要作用,但其具体作用机制均有待进一步研究。