【背景】缺血性心脏病（Ischemic heart disease,IHD）是世界上最常见的卫生健康问题和心功能不全的主要原因。IHD作为一种常见的慢性疾病,常可导致心肌缺血、缺氧甚至坏死,对人体健康构成严重威胁。IHD的一个重要病理生理学机制是氧化应激损伤,在氧化应激损伤过程中不仅会引起细胞发生凋亡、自噬,还会造成细胞能量代谢的转变。这种能量代谢的转变主要表现为三羧酸循环作用、线粒体氧化呼吸链功能、氧化磷酸化作用的抑制和糖酵解作用的增强。能量代谢转变有效地改善了缺氧诱导的氧化应激损伤条件下的能量供给,是一种典型的适应性反应。因此,深入研究氧化应激损伤条件下心肌能量代谢转变对改善IHD的治疗和预后至关重要。能量代谢过程中的某些蛋白,其活性与Sirtuins家族的去乙酰化修饰作用密切相关。作为Sirtuins家族成员之一的SIRT3是位于线粒体中最重要的去乙酰化酶。SIRT3参与调控三羧酸循环（如:IDH、SDH、MDH）等能量代谢过程中多种酶的活性。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）在SIRT3介导的去乙酰化反应过程中起辅助因子的功能,是影响SIRT3活性的主要因素。铁硫簇是线粒体氧化呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（ComplexⅠ、Ⅱ、Ⅲ）中传递电子的重要功能性辅助因子。其中ComplexⅠ是维持NAD⁺/NADH动态平衡的关键调节因素。铁硫簇装配蛋白（Iron sulfur cluster assembly protein,ISCU）是铁硫簇组装过程中的分子伴侣,起到支架作用,同时ISCU能够将组装成熟的铁硫簇传递给目标蛋白。研究发现,敲除ISCU会抑制ComplexⅠ的活性,造成氧化呼吸链的功能障碍。MicroRNA（miRNA）是一种单链、非编码的小分子RNA,其通过抑制特定靶基因mRNA翻译或促进相应靶基因mRNA降解,以调节靶基因的表达。MicroRNA-210（miR-210）是目前公认的一种缺氧诱导的mi RNA。研究表明,miR-210在细胞凋亡、细胞自噬和血管生成等过程中发挥重要作用。MiR-210因其在心血管疾病诊疗中的潜在应用价值而受到越来越多的关注。课题组前期研究发现,在过氧化氢（Hydrogen Peroxide,H₂O₂）诱导H9c2心肌细胞氧化应激损伤条件下,miR-210表达上调。MiR-210通过抑制心肌细胞凋亡和自噬,起到保护心肌细胞的作用。然而,在氧化应激损伤过程中,miR-210对心肌细胞能量代谢转变的影响尚不清楚。【目的】本实验应用H₂O₂处理H9c2细胞,建立氧化应激损伤模型,观察心肌细胞能量代谢转变的情况。以SIRT3、ISCU为研究切入点,探究氧化应激损伤条件下,miR-210对心肌细胞能量代谢转变的影响以及作用机制,以期为miR-210应用于心血管疾病的诊疗提供新线索和新思路。【方法】1.应用H₂O₂处理H9c2细胞,建立氧化应激损伤模型。通过CCK检测细胞生存率;应用试剂盒检测细胞ATP与乳酸生成的情况以评估细胞能量代谢;通过PCR array检测糖代谢基因的变化。2.通过慢病毒转染,构建miR-210高表达的H9c2细胞模型,应用qPCR检测细胞中miR-210的表达;应用试剂盒检测miR-210高表达组与对照组细胞中乳酸生成情况;通过PCR array检测mi R-210对糖代谢基因的影响。3.应用Western Blot检测miR-210高表达组与对照组细胞中SIRT3蛋白的表达;应用qPCR检测miR-210高表达组与对照组细胞中SIRT3 mRNA的表达;应用试剂盒分别检测mi R-210高表达组与对照组细胞中NAD⁺/NADH比率及SIRT3蛋白活性。4.通过慢病毒转染,构建miR-210低表达的H9c2细胞模型,应用qPCR检测细胞中miR-210的表达;应用Western Blot检测miR-210高表达组、低表达组及对照组细胞中ISCU、NDUFA9蛋白的表达;应用qPCR检测miR-210高表达组、低表达组及对照组细胞中ISCU mRNA的表达;应用试剂盒检测高表达组、低表达组及对照组细胞中ComplexⅠ的活性。【结果】1.在1 mM H₂O₂的作用下,随着作用时间的延长,细胞生存率及ATP含量呈递减趋势。乳酸含量增高并在H₂O₂作用1 h时表达最高,此后,随着H₂O₂作用时间的延长,乳酸含量呈递减趋势。与H₂O₂组相比较,联合应用糖酵解抑制剂2-DG（10 m M,1 h）组的细胞生存率、ATP及乳酸含量均降低。通过PCRarray检测在H₂O₂作用下细胞糖代谢基因的表达,结果显示糖酵解基因Gck、Hk3、Pklr表达增高。2.在H₂O₂（1mM,1 h）作用下,H9c2细胞中miR-210表达水平上调。与对照组相比,mi R-210高表达组乳酸含量增高。在没有H₂O₂作用情况下,miR-210高表达组中Gck,Hk3基因表达增高,Pck2,Pdk4基因表达降低;在H₂O₂（1mM,1 h）作用情况下,miR-210高表达组中以Hk3、Pgk2为代表的糖酵解基因表达增高,以Pck1、Pc为代表的糖异生基因、以IDH2、SDHA、MDH1为代表的三羧酸循环基因表达降低。3.在H₂O₂（1mM,1 h）的作用下,SIRT3蛋白及mRNA表达水平降低;miR-210高表达组中SIRT3蛋白及mRNA表达发生了更为明显的降低。NAD⁺/NADH比率可以作为反映SIRT3蛋白表达活性的指标。在H₂O₂（1mM,1 h）的作用下,NAD⁺/NADH比率及SIRT3蛋白活性降低,而miR-210高表达组中NAD⁺/NADH比率及SIRT3蛋白活性降低得更为显著。4.在H₂O₂（1mM,1 h）的作用下,ISCU蛋白及mRNA表达水平降低;miR-210高表达组中ISCU蛋白及mRNA表达发生了更为明显的降低,而mi R-210低、表达组中ISCU蛋白及mRNA表达增高。为了进一步证实miR-210对ISCU调节的特异性,我们检测了NDUFA9蛋白的表达,结果显示miR-210转染与H₂O₂处理均不影响NDUFA9的蛋白水平。最后,为了确定miR-210通过抑制ISCU以调节线粒体氧化呼吸链功能,我们检测了ComplexⅠ的酶活性。在H₂O₂（1mM,1 h）的作用下,ComplexⅠ的酶活性降低,miR-210高表达组中ComplexⅠ的酶活性降低得更为显著,而miR-210低表达组中ComplexⅠ的酶活性增高。【结论】在H₂O₂诱导氧化应激损伤过程中,心肌细胞发生能量代谢的转变。在H₂O₂诱导心肌细胞氧化应激损伤条件下,miR-210可通过以下途径促进心肌细胞能量代谢转变:（1）MiR-210促进糖酵解基因的表达,抑制糖异生及三羧酸循环基因的表达;（2）MiR-210降低SIRT3的表达与活性,抑制三羧酸循环的功能;（3）MiR-210通过抑制ISCU的表达,抑制线粒体氧化呼吸链的功能。【创新点与研究意义】本研究从心肌能量代谢的角度,探究miR-210对氧化应激损伤条件下心肌细胞的影响,并通过PCR array技术大规模筛选氧化应激损伤条件下,miR-210可能调控的糖代谢相关基因。本研究从心肌能量代谢的角度,为氧化应激损伤提供新的证据支持;为miR-210参与的心血管疾病的发生发展提供新的机制理论;为进一步推进miR-210应用于临床诊疗工作提供新的研究思路。