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目的脑型WD患者的神经症状加重,致死致残率高的困境是临床医师急切需要解决的难题,从研究WD脑神经元的线粒体损伤和青霉胺联合硫辛酸保护治疗的疗效为切入点,通过临床病例、动物实验和细胞实验的研究,探索WD脑神经元线粒体损伤机制,尝试利用青霉胺联合硫辛酸保护治疗来研究脑神经元的线粒体损伤相关蛋白变化及调控机制,在亚细胞器水平调控细胞损伤,修复线粒体功能,为临床脑型WD的治疗提供新思路。方法1脑型WD影像学分析和临床初步研究1.1 WD脑线粒体损伤的临床及影像学研究回顾性分析2008年1月至2017年12月临床确诊的364例脑型WD患者颅脑影像学损伤特点,选择2018年1月至2018年12月临床确诊的且疗效不佳的58例脑型WD患者的临床资料、颅脑MRS及血乳酸等生化指标进行研究,同时选择年龄相匹配的63例非WD患者的颅脑MRS及血乳酸等检查作为对照组,从临床方面发现脑型WD患者的脑神经元存在线粒体损伤的证据。1.2 PCA联合LA治疗脑型WD患者的回顾性分析随机选择临床PCA联合LA治疗脑型WD,与单用PCA治疗脑型WD,比较两组在治疗一个月后,发生神经症状加重的病例数。2青霉胺联合硫辛酸治疗对铜负荷SD大鼠/TX乳鼠脑神经元线粒体损伤的影响2.1动物实验,铜负荷SD大鼠脑神经元线粒体损伤及青霉胺联合硫辛酸保护治疗的研究方法选择铜负荷SD大鼠作为本研究的WD动物模型,造模成功后,分为五组进行研究,分别为对照组,铜负荷模型组,PCA治疗组,LA治疗组和PCA联合LA治疗组,检测各组实验鼠的血铜生化指标及AAS法检测脑组织的铜等含量,研究各组脑神经元的线粒体电镜结构,免疫组化法和Western blot法检测铜负荷SD大鼠各组脑神经元的LC3、Cyt C、XIAP和ERK1/2蛋白表达水平。从动物实验水平寻找铜负荷对脑神经元线粒体损伤的证据及证实青霉胺联合硫辛酸保护治疗是其神经元修复的最佳治疗方案。2.2细胞实验,TX乳鼠脑神经元线粒体损伤及青霉胺联合硫辛酸保护治疗的研究方法使用原代TX模型鼠神经细胞培养技术,培养成功后,分为五组进行研究,分别为DL对照组,TX乳鼠模型组,PCA治疗组,LA治疗组和PCA联合LA治疗组,拟用差速离心法获得WD遗传模型-TX小鼠脑组织线粒体,流式细胞术检测ROS和线粒体膜电位,利用光谱学和酶标仪检测线粒体复合物、关键酶活性,Western blot检测LC-3、Cyt-C、XIAP和ERK1/2蛋白表达水平。从细胞水平验证其脑神经元线粒体损伤及青霉胺联合硫辛酸保护治疗是其神经元修复的最佳治疗方案。结果1脑型WD影像学分析和临床初步研究1.1 364例脑型WD的颅脑MRI研究结果:回顾性分析临床资料中364例WD患者均有明确的WD神经症状诊断,颅脑MRI检查发现至少存在一个检查大脑区域异常,壳核异常最常见,其次是脑桥异常和丘脑异常等。无论脑型WD患者临床存在哪种神经症状,壳核都是最常受损的大脑区域;小于10岁以下的脑型WD患者脑损伤显示仅仅在壳核;病程短的脑型WD患者脑损伤绝大数是壳核异常,随着病程延长,脑损伤部位逐渐广泛。1.2选择58例脑型WD的颅脑MRI、MRS及血乳酸等指标研究结果:58例脑型WD患者颅脑损伤部位异常率,除小脑部位(P=0.228)外,均高于健康对照组(P<0.05),颅脑的颞叶部位MRS检测发现Las峰异常出现率和NAA下降异常率显著高于健康对照组(P<0.001),同时发现本组资料中WD患者静止状态血乳酸和乳酸/丙酮酸的比值要显著高于健康对照组(P<0.001)。1.3 PCA联合LA治疗脑型WD患者的初步结果:PCA联合LA治疗的23例脑型WD患者中,仅有1(4.3%)例出现神经症状加重,而单用PCA治疗的21例脑型患者中,有6(28.6%)例出现神经症状加重,两者之间差异具有统计学意义(P=0.042),即PCA联合LA治疗要优于单用PCA治疗。2青霉胺联合硫辛酸治疗对铜负荷SD大鼠/TX乳鼠脑神经元线粒体损伤的影响2.1动物实验结果2.1.1铜负荷SD大鼠的血铜生化及AAS检测脑组织铜等含量的结果:本组资料中铜负荷SD大鼠存在肝功能损伤,血清铜、CP含量降低,符合Wilson病患者的肝功能和铜代谢特点,证实用铜负荷SD大鼠作为研究WD的动物模型准确可靠。同时本研究中检测铜负荷大鼠的脑组织铜含量增高及实验过程中出现行走不稳等症状,与脑型WD患者类似。2.1.2铜负荷SD大鼠各组脑神经元的电镜结构的结果:显示铜负荷模型组大鼠脑神经元线粒体损伤较对照组明显,PCA联合LA治疗组大鼠的脑神经元线粒体结构较铜负荷模型组及PCA治疗组、LA治疗组均有改善。2.1.3铜负荷SD大鼠各组脑神经元的免疫组化和Western blot法检测结果:TX乳鼠模型组的LC3,Cyt C蛋白表达较DL对照组明显上调(P<0.01),经过治疗后PCA联合LA治疗组大鼠(n=7)的脑神经元LC3,Cyt C蛋白表达水平较TX乳鼠模型组(n=7)及PCA治疗组、LA治疗组(n=7)均有下调(P<0.01);ERK1/2和XIAP蛋白表达较DL对照组明显下调(P<0.01),经过治疗后PCA联合LA治疗组大鼠(n=7)的脑神经元ERK1/2和XIAP蛋白表达水平较TX乳鼠模型组(n=7)及PCA治疗组、LA治疗组组(n=7)均有上调(P<0.01)。2.2细胞实验结果2.2.1流式细胞学检测各组TX/DL乳鼠神经元细胞ROS和JC-1结果:发现TX小鼠神经元内ROS释放量增加,存在氧化应激损伤,PCA联合LA治疗组能显著降低神经元内ROS的产生,减轻氧化应激损伤。检测线粒体膜电位,发现神经元线粒体膜电位水平显著下降,加入LA和PCA后,JC-1主要呈聚合物状态,细胞线粒体膜电位上升,与TX乳鼠模型组相比较,差异具有统计学意义(P<0.01),且PCA联合LA治疗组JC-1的荧光强度显著高于PCA治疗组或LA治疗组。2.2.2利用光谱学和酶标仪检测各组TX/DL乳鼠神经元细胞的线粒体复合物及关键酶活性的结果:通过测定TX乳鼠神经元线粒体复合体Ⅰ-Ⅳ活性,结果发现TX乳鼠神经元线粒体复合体Ⅰ-Ⅳ活性均降低,其中复合体Ⅰ活性降低最明显。通过检测TX乳鼠神经元线粒体内重要脱氢酶:苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)、丙酮酸脱氢酶复合体(PDH)、顺乌头酸酶(Aco)活性,发现TX乳鼠神经元线粒体NAD-MDH、PDH、Aco活性均降低;PCA联合LA治疗组可提高TX乳鼠神经元NAD-MDH、PDH、Aco活性,与TX乳鼠模型组比较,线粒体内重要脱氢酶如NAD-MDH、PDH、Aco活性的提高具有显著统计学意义(P<0.01)。2.2.3 Western blot检测各组TX/DL乳鼠神经元细胞线粒体相关蛋白的结果:TX乳鼠模型组乳鼠神经元内LC3和Cyt C蛋白含量显著升高、XIAP和ERK1/2蛋白显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。经治疗后,与TX乳鼠模型组相比:PCA联合LA治疗组的LC3和Cyt C蛋白表达显著下降,XIAP和ERK1/2蛋白显著升高(P<0.01)。结论1.脑型WD患者的脑损伤最常见、最先累及的部位是壳核,通过颅脑MRS和血乳酸检测发现其存在神经元线粒体损伤。2.脑型WD患者首次就诊,选择PCA联合LA治疗,极少出现神经症状加重。3.铜负荷SD大鼠的脑神经元线粒体损伤不仅体现在线粒体结构异常,而且与线粒体损伤相关蛋白,如LC3、Cyt C和XIAP等表达均存在异常,经过青霉胺联合硫辛酸保护治疗后,与对照组,与模型组比较,各项线粒体损伤指标均有明显改善。4.TX乳鼠皮层神经元培养后检测线粒体相关指标,如ROS,JC-1,线粒体复合物,线粒体关键酶及LC3、Cyt C和XIAP等均存在明显异常,经过青霉胺联合硫辛酸保护治疗后,与对照组,与模型组比较,各项线粒体损伤指标均有明显改善。5.脑型WD的治疗新思路是青霉胺联合硫辛酸保护治疗,是预防其神经症状加重,减少致死致残率的有效方法。