1.研究背景： 青光眼是全球第二位的不可逆性致盲眼病，积极调控眼压到靶眼压水平仍然是目前治疗青光眼的有效手段。临床上绝大部分青光眼是因房水外流阻力增加所致。一般认为房水排出途径有两条：通过小梁网的经典途径和通过葡萄膜巩膜的非经典途径。近几年来，随着新的研究手段应用，葡萄膜巩膜房水外流途径的重要性更加引起人们的关注，有关研究结果表明：前列腺素类(Prostaglandins，PGs)药物通过与其受体结合，促进基质金属蛋白酶(Matrix metalloprotinase，MMPs)的合成和分泌增加，使睫状肌细胞外基质(Extracellular maxtrix，ECM)分解，从而降低葡萄膜巩膜房水外流的阻力。但是，为什么局部使用较低浓度的PGs药物(如0.004％ Travatan)能在24小时内有效地降低眼压，其作用甚至强于传统的一线药物0.5％的噻吗心安?影响MMP合成和分泌的分子机制是什么?葡萄膜巩膜房水外流的调节机制又是怎样的?这些问题的提出，迫使人们将研究的焦点集中到影响MMP作用的上游-细胞信号的传导系统这一关键环节，这已成为目前青光眼研究的一个热点。核转录因子(Nuclear factor Kappa B，NF-κB)是近年发现的一种重要的转录因子，存在于多种细胞，它与其抑制物IκB构成系统，参与炎症、免疫、细胞增殖和细胞凋亡等多种生理、病理过程的基因调控及某些MMPs的调控，而有关其在葡萄膜巩膜房水外流途径中的作用尚不清楚。而RNA干扰技术的应用，更为上述问题的解决提供了可能。 2.研究目的： 本研究运用RNA干扰技术沉默IκB基因表达，观察核转录因子NF-κB及其抑制物IκB系统对葡萄膜巩膜房水外流的分子调控，以及MMP-2在葡萄膜巩膜房水外流通道的作用，力图阐明葡萄膜巩膜房水外流的分子机制。从而进一步了解青光眼的发病机理，丰富青光眼房水流出作用机制理论，为青光眼的治疗提供新的、更有效的手段。 3.研究方法： 3.1正常人眼睫状肌细胞体外培养和鉴定：取正常供体新鲜的睫状肌，利用组织块培养法，进行睫状肌细胞体外培养，用相差显微镜观察，细胞免疫组织化学法鉴定。 3.2设计、合成靶向IκBa基因的siRNA，筛选得到具有高效干扰效率的siRNA。 3.3设计空白对照组、阴性对照组、实验组，利用脂质体Lipofectamine 2000将siRNA转入体外培养的人眼睫状肌细胞。分别于转染后24h、48h、72h用Real-time RT-PCR技术检测IκBα、NF-κBp65和MMP-2在mRNA水平的表达；用Western blot技术检测IκBα、NF-κBp65和MMP-2在蛋白水平的表达；用免疫荧光技术检测RNA干扰24h、48h、72h后NF-κBp65的活性；用Zymography技术测定MMP-2活性。 4.研究结果： 4.1体外成功培养出正常人眼睫状肌细胞，胞体狭长，胞浆丰富、胞核大、增殖能力强，呈典型峰谷状生长，Smooth muscle a-actin和Desmin染色均呈阳性。 4.2设计合成的3对siRNA经筛选后获得1对高效的siRNA。体外培养的人睫状肌细胞经RNA干扰后随检测时间点的延长，IκBα的mRNA和蛋白表达受到抑制的程度加深，在72h时仅抑制率分别92.7％±1.6％和87.3±2.0％。 4.3在RNA干扰24h、48h、72h后睫状肌细胞NF-κBp65的mRNA和总蛋白表达均无明显变化，但核蛋白中NF-κBp65的表达明显升高，免疫荧光检测示NF-κBp65移位明显，活性增强。MMP-2的mRNA和蛋白表达呈逐渐升高趋势，其proMMP-2和active MMP-2的量也相应增多。 5.结论： 5.1 RNA干扰技术可以在72h内持续高效地抑制IκBα的表达。 5.2葡萄膜巩膜房水外流机制可能是：由于IκBα表达受到抑制，使得NF-κB p65被激活，转位入睫状肌细胞核，促进了MMP-2分泌和激活，从而使睫状肌细胞外基质(ECM)降解，增加了葡萄膜巩膜房水的外流。