荧光假单胞菌(Psendomonas fluorescens)是一种重要的植物根际促生细菌，从植物根围分离到的荧光假单胞菌大部分都具有防病增产作用，因而可能用于植物病害的生物防治。荧光假单胞菌能否在根部、叶部及其它部位定殖是决定其能否有效控制植物病害的关键。形成生物膜是细菌在各种不同环境中定殖的一个重要策略，在植物根表面微菌落的形成被认为是生物膜形成的一种形式。以往对荧光假单胞菌生物膜形成、相关基因在根部定殖中的作用以及对荧光假单胞菌生防活性的影响等方面的研究不多。本研究旨在从植物根际土壤中筛选对植物病原真菌具有较强抑制作用的荧光假单胞菌，开发其在植物病害生物防治中的潜力，并研究生物膜形成机制及其在根部定殖和生防活性中的作用。从山东、云南、海南和新疆采集的488份土壤样品中筛选到102株杆状单极生鞭毛产荧光假单胞菌。利用限制性酶切片段多态性分析(ARDRA)技术结合传统生理生化方法，鉴定获得了一株高效荧光假单胞菌菌株P．fluorescens TC222。该菌株对油菜立枯病菌、小麦根腐病菌、稻瘟病菌、菜豆炭疽病菌、番茄叶霉病菌、小麦全蚀病菌、白菜黑斑病菌、烟草黑胫病菌、番茄灰霉病菌和芦笋茎枯病菌等多种蔬菜和粮食作物病原真菌均有较强的抑制作用，并且能够在小麦根际较好定殖，显示了在生物防治中应用的潜力。ARDRA方法的应用也为荧光假单胞菌的筛选鉴定找到了一条简便易行的途径。对携带mini-Tn5转座子的pJBA28质粒进行改造，构建了带有大肠杆菌复制区、可以使目的基因在酶切、自连、转化后能够在大肠杆菌中自行复制的转座子质粒载体pJB15A，为荧光假单胞菌重要功能基因的分离克隆提供了新的便利的研究工具。利用pJB15A构建了P．fluorescens TC222的转座突变库，获得10，000株具有卡那霉素抗性的接合突变体。通常发现生物膜突变体的运动能力也发生改变或者受到破坏，因此运动性被用来作为筛选生物膜突变体的表型性状。在10，000株突变菌株中筛选到8株性状比较稳定的运动缺陷突变体，分别命名为：Lip1、Lip2，Lip3；Fla4，Fla5；Hyp6、Hyp7和Hyp8。生长曲线测定结果显示8个突变体的生长速度与野生菌株差异不显著，说明运动性状改变并非由生长特性变化所引起。在亲水的硼硅酸盐试管介质表面对8个突变株生物膜的形成能力进行了测定。突变体Lip、Hyp6、Hyp7和Fla生物膜形成比野生菌株明显降低，Hyp8则稍有增加；而在疏水的聚苯乙烯介质表面，Hyp6、Hyp7和Fla生物膜形成能力降低，Lip和Hyp8则增加。根部竞争定殖和对病原真菌抑制作用测定发现，这些突变株在小麦根部的竞争定殖和对病原真菌的抑制能力均降低。克隆了8个突变菌株的转座子侧翼序列并进行同源性比较。在突变株Lip、Fla、Hyp6、Hyp7和Hyp8中，突变分别发生在dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶基因lipA、鞭毛合成蛋白基因flaR、噬菌体信号肽蛋白基因bspA、编码Mig-14族蛋白基因epsB和可溶的嘧啶核苷转氢酶基因pyrA中。说明这些基因都参与了生物膜的形成，并且不同程度地影响了抑菌作用。而且epsB、bspA和pyrA是首次发现参与荧光假单胞菌生物膜的形成过程，为生物膜形成机制的深入研究创造了条件。为了验证生物膜形成的破坏是由基因突变引起的，选择lipA和epsB进行了功能互补实验，结果表明，携带lipA和epsB的广宿主质粒均分别部分恢复了突变株Lip1和Hyp7韵生物膜形成。半定量RT-PCR分析发现，在野生菌株TC222和恢复菌株Lip1C和Hyp7C中，基因lipA和epsB在转录水平上都有不同程度的表达，而突变菌株的转录却受到破坏。为了进一步证明epsB是位于潜在的胞外多糖合成操纵子中，利用RT-PCR方法分析了epsB的协同转录情况，结果表明epsB与其上下游基因位于同一个转录单位中，从而解释了恢复菌株无法恢复生物膜到野生菌株水平的原因。此外，对基因lipA和epsB进行了大肠杆菌BL21中的表达分析，lipA和epsB均在沉淀中表达了约30kD的蛋白。