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目的通过比较肺的正常细胞和癌细胞的差异,发现差异基因ENPP1,研究ENPP1作用的分子机理及关键性靶向信号通路,揭示ENPP1促进肺癌发生的作用及生物学意义。材料与方法1.利用mRNA表达谱芯片分析比较野生型与Gprc5a基因敲除型小鼠气管上皮细胞(MTEC)的差异表达,发现基因ENPP1的显著性差异,并用RT-PCR的方法在mRNA水平上验证。并通过Oncomine数据库对现有的数据进行分析,确定ENPP1在正常人中和肺癌患者中的差异表达具有重要意义。2.构建一系列ENPP1高表达,敲低及功能序列突变的质粒,在人的肺癌细胞系中,构建ENPP1高表达,敲低,的稳定表达株,通过体内和体外实验验证ENPP1对人肺癌细胞生长及成球能力的影响。3.通过流式细胞术和Westernblot技术,在已获得人的ENPP1敲低细胞株(A549,HCC827)检测其干性标志物的变化;裸鼠皮下移植实验,研究ENPP1对肺癌细胞在裸鼠皮下成瘤的影响。4.通过划痕实验检测敲低ENPP1对人的肺癌细胞系的迁移速率影响;运用Westernblot和免疫荧光实验探究ENPP1敲低后对TGF-β引起的EMT相关蛋白表达及其对蛋白定位的影响。5.利用肺癌病人癌和癌旁的组织蛋白样品,通过Westernblot,检测ENPP1的表达情况;并利用免疫组织化学技术,检测人的肺癌和癌旁的组织芯片中ENPP1的表达情况。结果1.基因组表达谱芯片结果表明,抑癌基因Gprc5a基因敲除老鼠的支气管上皮细胞同野生型支气管上皮细胞相比,其ENPP1信号通路发生显著增高。并且在Oncomine大数据中,ENPP1在肺癌中较正常人表达显著增高。2.在人的非小细胞肺癌细胞系HCC827和A549中敲低ENPP1与其对照组相比,其克隆生长及成球能力显著下降。3.在人的非小细胞肺癌细胞系HCC827和A549敲低ENPP1与其对照组相比,肿瘤细胞相关的干性标志物的表达显著下调。裸鼠皮下成瘤结果表明,HCC827敲低ENPP1组与对照组相比其成瘤能力显著下降。4.在人的非小细胞肺癌细胞系HCC827和A549中敲低ENPP1组与其对照组相比,细胞的迁移速率显著降低,并且由TGF-β引起的EMT现象及其对相关的蛋白的表达影响明显减弱。5.在人的肺癌和癌旁的蛋白裂解液和组织芯片中,ENPP1在癌中的表达明显高于癌旁。结论1.无论在人的肺癌还是小鼠的肺癌模型中ENPP1的表达较其癌旁都显著增高。2.在人的非小细胞肺癌细胞系HCC827和A549中敲低ENPP1可降低其生长及成球能力。3.在人的非小细胞肺癌细胞系HCC827和A549中敲低ENPP1可下调肿瘤细胞干性标志物的表达及裸鼠皮下成瘤能力。4.在人的非小细胞肺癌细胞系HCC827和A549中敲低ENPP1可减弱由TGF-β引起的EMT现象及其对相关的蛋白的表达影响。