立题依据和目的:随着人类基因组计划的完成,研究基因的功能成为目前生命科学界关注的焦点,表遗传学(epigenetics)提供了何时、何地和如何应用遗传学信息的指令,将成为阐明基因组功能的关键研究领域之一。表遗传学是指不发生DNA序列改变的、可遗传的基因表达改变,包括两个方面的重要内容:(一)DNA甲基化;(二)组蛋白修饰(甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和糖基化)。而DNA甲基化是各种表基因机制的最后表现形式。DNA甲基化是指DNA 5位胞嘧啶的甲基化,引起基因表达异常而DNA序列不改变。哺乳动物基因组中5-甲基胞嘧啶集中在二核苷酸胞嘧啶(CpG)结构中,位于基因的启动子和第一外显子的CpG岛的甲基化与基因失活密切相关。免疫系统被认为是一个解析表遗传学调控机制的良好模型,而且免疫细胞的分化及功能表达和表遗传学的联系甚密。各型CD4+T辅助细胞亚群分化过程中相应细胞因子可发生甲基化状态的改变,以促进T细胞定向分化。很多自身免疫性疾病涉及自身反应性淋巴细胞的激活,并可伴有某些功能性亚群的极化,由此开启各种基因表达的表遗传学调控。类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)属自身免疫性疾病,发病机制尚不明。研究表明CD4+T辅助细胞亚群在RA进展中的作用具有重要意义。很多研究发现RA患者Th1/Th2细胞失衡,Th1及Th1细胞因子占优势,活动期RA患者外周血中Treg细胞数量明显较健康人减少,RA患者血清和关节液中Th17型细胞因子IL-17增高。另外,在GPI(glucose-6-phosphate isomerase)诱导的关节炎模型小鼠体内发现Th1、Th17细胞占优势。以上发现提示,Th1、Th2、Treg和Th17相关的细胞因子在RA进展中发挥了重要作用。最近研究表明RA存在T细胞基因组DNA低甲基化及死亡受体3(death receptor 3, DR3)启动子高甲基化,提示DNA甲基化可能影响RA的发生发展。而关于RA患者体内Th1、Th2、Treg、Th17相关细胞因子基因甲基化状态尚无研究报道。组织特异的DNA甲基化谱是哺乳动物基因组的一个显著特征,因此制定类风湿性关节炎Th1、Th2、Treg、Th17相关细胞因子DNA甲基化谱对早期诊断有重要意义。表遗传学是不改变基因序列的修饰,为疾病的治疗带来新的希望。应用甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine, 5-azaC)可以使甲基化的启动子去甲基化,启动基因重新转录;高浓度同型半胱氨酸(homocystine, Hcy)可以介导基因甲基化而抑制其表达。通过5-azaC或Hcy改变特定细胞因子基因甲基化状态,启动或抑制相应细胞因子的表达,将有助于缓解RA病情。本研究论文以Th1、Th2、Treg、Th17相关细胞因子平衡失调为切入点,通过检测类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞Th1型细胞因子如IL-1β、TNF-α和IFN-γ,Th2型细胞因子如IL-4和IL-10,Treg型细胞因子IL-10和Th17型细胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-17的甲基化状态与mRNA表达的关系,分析甲基化与类风湿性关节炎的相关性,筛选对RA早期诊断具有借鉴意义的甲基化指标;进而通过5-azaC、Hcy处理体外培养的RA患者外周血单个核细胞,观察对这些指标的甲基化逆转和基因表达调节作用,探讨RA发生发展中可能的表遗传学机制,对早期诊断、评价病程发展提供借鉴,为治疗寻找新的靶点提供实验依据。方法:1观察类风湿性关节炎患者外周血Th1、Th2、Treg、Th17相关细胞因子平衡失调状态收集处于活动期的类风湿性关节炎患者,符合1987年美国风湿病协会修订的类风湿性关节炎诊断标准,并根据2003年欧洲抗风湿病联盟会议对早期RA的定义,将病程在2年之内(含2年)的RA定义为早期RA,有34例,非早期RA 30例。男:女=1:3,并记录相关临床资料。采集性别和年龄匹配的健康志愿者作为对照组。密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,RT-PCR、ELISA法分别检测外周血单个核细胞Th1(IL-1β, TNF-α, IFN-γ)、Th2(IL-4, IL-10)、Treg(IL-10)、Th17(IL-1β, TNF-α, IL-17)型细胞因子mRNA及血清中蛋白表达,并与疾病活动性指标(ESR、CRP、RF、晨僵时间、累及关节数)进行相关性分析,观察不同病程阶段RA患者外周血中Th1、Th2、Treg和Th17细胞相关细胞因子的动态变化趋势,分析各细胞因子表达变化与疾病进展的关系,初步探讨RA炎症进展的机制。2类风湿性关节炎相关炎症因子基因甲基化提取单个核细胞DNA,进行亚硫酸氢钠修饰,发生甲基化的DNA在修饰后序列不发生改变,未发生甲基化的DNA在修饰后CpG中5’端的“C”全部转换成“U”,根据修饰后DNA序列的不同,运用在线MethPrimer软件设计引物,甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction, MSP)检测RA病人和健康个体上述细胞因子启动子甲基化状态。分别选取各基因甲基化PCR和非甲基化PCR产物测序。分析启动子甲基化与其mRNA表达之间的相关性,并分析甲基化与疾病活动性指标(ESR、CRP、RF、晨僵时间、累及关节数)的相关性,筛选对RA早期诊断具有借鉴意义的甲基化指标,探讨DNA甲基化在RA发生发展中的作用。3观察甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷对IL-10、IL-4的甲基化逆转作用,进一步证实DNA甲基化与基因表达间的关系我们选用筛选出的在RA存在异常高甲基化的IL-10、IL-4基因作为研究对象,以5-氮杂胞苷处理体外培养的RA患者外周血单个核细胞,采用MSP方法检测5-氮杂胞苷不同剂量、不同作用时间对IL-10、IL-4基因甲基化状态的逆转作用,RT-PCR、ELISA法检测5-氮杂胞苷处理前后IL-10、IL-4 mRNA和蛋白表达变化,采用染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation, CHIP)检测药物处理前后IL-10启动子与磷酸化CREB(phospho-CREB, p-CREB)结合活性变化,焦磷酸测序方法对药物处理前后IL-10启动子区5个CpG位点甲基化进行定量检测,分析不同位点甲基化与转录的关系;同时RT-PCR检测药物处理前后甲基化特异性结合蛋白MeCP2、DNA甲基转移酶DNMT1和DNA去甲基化酶mbd2的mRNA表达变化,探讨5-氮杂胞苷对RA外周血IL-10、IL-4基因甲基化逆转及调节基因转录的机制。4观察同型半胱氨酸对IL-1β、TNFα和IL-17基因甲基化及表达的影响选用筛选出的在RA存在异常低甲基化的IL-1β、TNFα和IL-17基因作为研究对象,以同型半胱氨酸处理体外培养的RA患者外周血单个核细胞,MSP方法检测同型半胱氨酸不同剂量、不同作用时间对IL-1β、TNFα和IL-17基因甲基化状态影响,RT-PCR、ELISA法检测IL-1β、TNFα和IL-17 mRNA和蛋白表达的变化,同时RT-PCR法检测MeCP2、DNMT1和mbd2的mRNA表达变化,初步探讨同型半胱氨酸介导RA外周血单个核细胞IL-1β、TNFα和IL-17基因甲基化及调节基因转录的机制。5遗传学调查采集7例真父-子-母三联体家系外周血,提取基因组DNA,经亚硫酸氢钠处理后,MSP方法检测IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17基因甲基化状态,分析基因甲基化在世代之间传递的规律,初步探讨甲基化发生的机制。结果:1活动期RA患者外周血单个核细胞IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17 mRNA表达和血清中蛋白表达水平均高于健康对照组(P <0.05),IL-4、IL-10 mRNA和血清中蛋白表达水平均低于健康对照组(P <0.05)。早期RA患者IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17 mRNA和蛋白表达高于非早期RA患者,随病程延长,RA患者血清中IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17蛋白表达呈下降的趋势;早期RA患者IL-4、IL-10 mRNA、蛋白表达低于非早期RA患者,IL-4 mRNA与病程呈正相关(r=0.468, P <0.05),随病程延长,RA患者血清中IL-4、IL-10蛋白表达呈逐渐升高趋势。IL-17 mRNA与所累关节数呈正相关(r=0.581, P <0.05),IFN-γmRNA、蛋白表达与ESR呈正相关(r=0.466, P <0.05)(r=0.471, P <0.05)。2 IL-1β、IL-10、TNF-α、IL-17基因启动子甲基化状态与其mRNA表达呈负相关(r=- 0.401,P <0.05) (r=- 0.579,P <0.01) (r=- 0.452,P <0.05)(r=- 0.414,P <0.05)。IFN-γ、IL-4基因启动子甲基化状态与其mRNA表达无相关性(r=- 0.017,P >0.05)(r=- 0.154,P >0.05)。IL-10启动子甲基化与所累关节数显著相关(r=0.679,P<0.05),IL-17启动子甲基化与血沉(ESR)、类风湿因子(RF)显著相关(r=- 0.646,P<0.01)(r=- 0.601,P<0.05)。3与健康组比较,IL-10基因在RA组存在较高频率的甲基化(85.29% vs 43.33%, P <0.05),IL-1β、TNF-α、IL-17基因在RA组中甲基化率较低,而在相应健康组存在较高频率的甲基化(33.33% vs 82.61%, 6.67% vs 50%, 46.67% vs 85.42%; P <0.05),IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-17基因甲基化状态对临床早期诊断具有一定的借鉴意义。4 1μmol/L 5-azaC对IL-4、IL-10启动子甲基化状态逆转不明显,5μmol/L、10μmol/L 5-azaC的逆转甲基化作用显著,可以显著逆转IL-10启动子-62、-41、-39、-9 CpG位点高甲基化状态,+222 CpG低甲基化状态改变不显著,并且1μmol/L、5μmol/L 5-azaC使IL-4、IL-10 mRNA和蛋白表达升高(P <0.05),10μmol/L 5-azaC使其表达下降。5μmol/L 5-azaC可以使p-CREB与IL-10启动子结合活性升高(P <0.05)。5 200μmol/L Hcy可介导IL-1β、TNF-α、IL-17启动子甲基化,并抑制基因表达(P <0.05)。50μmol/L、100μmol/L Hcy对IL-1β、TNF-α、IL-17启动子甲基化状态影响不明显,使IL-1β、TNF-α、IL-17 mRNA表达量增加。6 5-azaC可使mbd2 mRNA表达升高(P>0.05),使MeCP2、DNMT1 mRNA表达下降(P>0.05)。Hcy可使mbd2 mRNA表达下降(P>0.05),MeCP2、DNMT1 mRNA表达量增加(P>0.05)。IL-4、IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-17启动子甲基化、mRNA表达与mbd2、MeCP2、DNMT1 mRNA表达量均无相关性(P>0.05)。7健康家系调查结果显示,IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17启动子甲基化在父、母与子代之间不符合孟德尔遗传规律,并且与遗传印记基因的亲源依赖性遗传方式亦不相同。结论:1早期RA患者外周血中Th1和Th17型细胞因子( IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17 )占优势,非早期RA患者外周血中Th2和Treg型细胞因子( IL-4、IL-10 )占优势,随着病程延长IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17表达逐渐下降,IL-4、IL-10表达逐渐升高,与RA活动有关。表明在初次发病及不同病程阶段,RA患者外周血中Th1/Th2、Treg/Th17型细胞因子存在不同的失衡状态。2早期RA患者IL-10基因呈高甲基化,IL-1β、TNF-α和IL-17基因低甲基化,DNA甲基化通过调控Th1/Th2、Treg/Th17型细胞因子失衡,参与了RA早期炎症状态的发生、发展,其甲基化状态对RA早期诊断具有一定的借鉴意义。3 IL-10启动子区上游的CpG位点(-62、-41、-39、-9)可能是调控其转录的关键序列。4通过5-azaC和Hcy可逆转体外培养的PBMCs炎症相关基因甲基化,恢复或抑制基因表达,为建立自体细胞体内回输治疗RA提供了实验依据。