论文部分内容阅读
在人和动物的生命活动中诸多不可或缺的必需微量元素扮演着重要角色,而硒(selenium,Se)元素正是其中之一。硒与人和动物机体的健康密切相关,当人体硒缺乏时能够导致克山病的发生,而动物也会出现如渗出性素质、白肌病等病理变化与疾病。硒元素在软骨组织功能的正常发挥中也起到至关重要的作用。动物体内硒的含量过低直接影响到躯体运动疾病的发生,如大骨节病(Kaschin-Beck disease,KBD)和骨关节炎(osteoarthritis,OA)都与硒缺乏有关。在生物体内,硒元素以硒蛋白(Selenoproteins,Sel)的形式来发挥其对生物体的调控功能。人类已经检测了来自不同动物类群的30多个硒蛋白基因序列。硒蛋白M(SelM)是硒蛋白硫氧还蛋白还原酶家族(Txnrds)的一员,在多种动物的不同组织中均有表达。鸡SelM被证实具有抗氧化功能,但其在保护鸡软骨组织免受凋亡损伤中发挥的作用机制仍不清楚。以深入了解SelM在软骨组织中的功能为目的,本研究建立缺硒鸡模型并对其中24种硒蛋白mRNA表达水平、SelM蛋白表达水平以及抗氧化指标(H202、CAT、SOD与MDA)进行检测,并通过在体外培养鸡胚胫骨软骨细胞中转染以SelM为靶基因的gga-miR-138-5p基因 Mimic 与 Inhibitor 建立 gga-miR-138-5p 过表达(Mimic 组)和敲低(Inhibitor 组)模型。对模型中抗氧化指标(H202、CAT、SOD与MDA)进行检测并对凋亡相关基因(BCL-2、Caspase-3、Caspase-9、BAX与BAK)进行mRNA水平与蛋白水平的检测,阐明SelM在保护鸡软骨组织氧化损伤导致的异常细胞凋亡中发挥的作用机制,研究结果如下:(1)对正常组(C组)与缺硒组(L组)鸡胫骨软骨组织中24种硒蛋白mRNA表达量进行比较分析后,发现在鸡胫骨软骨组织中SelM基因mRNA表达量最高,且受日粮中硒含量变化影响较大;缺硒鸡软骨组织中SelM蛋白表达量仅为正常组的75%。试验结果证明缺硒可显著降低SelM的表达。(2)在建立鸡原代软骨细胞体外培养模型的基础上,构建miR-138-5p过表达和敲低模型,Mimic组内Mimic最佳转染浓度为50nM,SelM基因mRNA表达量仅为C组的25%,蛋白表达量为C组的69%;Inhibitor组内Inhibitor最佳转染浓度为100nM,SelM基因表达量为C组的4.47倍,蛋白表达量为C组的1.66倍。同时通过双荧光素酶报告基因检测系统证明SelM为gga-miR-138-5p的靶基因。试验结果证明miR-138-5p靶向调控SelM表达。(3)与C组相比,L组鸡胫骨软骨组织中细胞凋亡、H202与MDA水平显著升高,而CAT与SOD活性显著下降;Caspase-3、Caspase-9、BAX以及BAK的mRNA与蛋白表达量均呈现上升趋势,BCL-2的mRNA与蛋白表达显著下降(P<0.05),miR-138-5p表达上升,细胞凋亡显著增加(p<0.05)。体外试验结果显示,与对照组比较,Mimic组H202与MDA水平显著升高,而CAT与SOD活性显著下降,Caspase-3、Caspase-9、BAX以及BAK的mRNA与蛋白表达量均呈现上升趋势,而BCL-2的mRNA与蛋白表达量均呈现降低状态;Inhibitor组H202与MDA水平呈现下降趋势,而CAT与SOD活性增加,Caspase-3、Caspase-9、BAX以及BAK的mRNA与蛋白表达量均比正常组低,而BCL-2的mRNA与蛋白表达量呈现升高状态。上述结果表明,缺硒可引起miR-138-5p表达上调,靶向SelM表达下调,进而引起软骨细胞发生氧化应激,通过线粒体通路诱导软骨细胞发生细胞凋亡。综上所述,缺硒能够降低软骨组织中24种硒蛋白的表达,上调miR-138-5p的表达,miR-138-5p通过靶向SelM引起软骨细胞发生氧化应激,通过线粒体通路诱导软骨细胞凋亡。