【背景】骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种主要表现为骨骼骨量的减少、骨组织微细结构的破坏,进而导致骨组织的脆性增加、骨骼强度的降低而易于发生骨折的全身性骨代谢障碍性疾病,多发生在老年和绝经后的女性。正常骨组织形态的维持主要取决于两个方面:成骨细胞和破骨细胞所发挥的成骨作用和骨吸收作用。这种耦联机制一旦被打破,就会引起许多骨代谢相关性疾病。而在引起成骨作用和骨吸收作用耦联失衡的诸多因素中,成骨细胞功能的减弱扮演者及其重要的角色。骨硬化蛋白(Sclerostin)是由SOST基因调控,主要表达于骨细胞。骨硬化蛋白作用于成骨细胞表面的低密度脂蛋白相关蛋白复合受体(LRP 5/6),从而拮抗成骨细胞胞内经典Wnt信号通路,进而对成骨细胞的功能发挥明显的负性调控作用。抗骨硬化蛋白的单克隆抗体通过与骨硬化蛋白特异性结合,进而特异性拮抗骨硬化蛋白对成骨细胞的负性调控作用,从而明显促进成骨细胞的骨形成作用,因此对骨代谢相关性疾病均有良好的治疗作用。但抗骨硬化蛋白单克隆抗体的制备工艺复杂,成本昂贵及抗体部分的不良反应限制了其广泛的临床应用。而疫苗作为主动免疫,通过诱导机体产生特异性针对内源性抗原的多克隆抗体也许是一个更好的策略。在主动免疫治疗中,疫苗能否突破自体蛋白的免疫耐受,并产生能特异性高亲和力结合自身蛋白抗原的抗体是其主要难点。本研究中,我们通过在骨硬化蛋白特定位点插入非天然氨基酸,从而有效突破了自体蛋白的免疫耐受,产生的高滴度抗体不仅能与突变型骨硬化蛋白结合,同时与内源性骨硬化蛋白也具有良好的交叉反应。本研究探讨了小鼠非天然氨基酸突变型骨硬化蛋白的原核表达和纯化,以及将其作为疫苗检测非天然氨基酸突变型骨硬化蛋白疫苗在小鼠骨质疏松模型(OVX)中的疗效与可行性,为进一步优化疫苗治疗骨质疏松症奠定了基础。【方法和结果】1.将经过密码子优化后的小鼠mSOST基因,构建pET28a-mSOST重组表达载体,然后分别将编码第115,121和126位氨基酸的密码子(AAC,AAG和AAC)定点突变为琥珀密码子(TAG),在pEVOL质粒共转染的情况下,编码p-硝基苯丙氨酸,然后将构建成功的pET28a-pNO2Phe mSOST重组表达载体送公司进行双向测序鉴定。2.野生型和p硝基苯丙氨酸突变型骨硬化蛋白的表达和纯化。诱导表达的菌体经裂解后进行SDS-PAGE与Western Blot检测,结果表明,p硝基苯丙氨酸突变型骨硬化蛋白在原核蛋白表达系统内成功表达。通过Ni-NTA亲和层析介质对骨硬化蛋白进行纯化,纯化后的骨硬化蛋白用超滤管进行蛋白浓缩。将浓缩后的骨硬化蛋白进行高效液相色谱联合质谱检测。结果表明,野生型骨硬化蛋白在特定位点成功插入了p-硝基苯丙氨酸。3.以纯化的野生型和p硝基苯丙氨酸突变型骨硬化蛋白免疫C57/BL雌性小鼠,最后一次免疫结束后第7天尾静脉取血,静置,去上层血清。抗血清活性用抗血清和骨硬化蛋白的结合实验来验证。而血清抗体滴度的检测采用酶联免疫吸附实验。结果表明,突变型骨硬化蛋白能突破自身免疫耐受产生高滴度,高特异性抗体,该抗体不仅能与突变型骨硬化蛋白相结合,同时与内源性骨硬化蛋白也具有良好的交叉反应。4.验证突变型骨硬化蛋白疫苗对骨质疏松模型小鼠的治疗效应。通过ELISA检测评估整个实验过程抗体滴度情况;通过血清学检测(骨钙素)骨形成情况以及显微CT技术检测骨密度、骨微架构等。结果显示非天然氨基酸突变型骨硬化蛋白疫苗对OVX模型小鼠骨质疏松有明显的治疗效果。【结论】本实验中,我们首次表达和纯化了小鼠p-硝基苯丙氨酸突变型骨硬化蛋白,并通过高效液相色谱联合质谱检测验证了野生型骨硬化蛋白特定位点(115,121和126)成功插入了p-硝基苯丙氨酸。然后将突变后的骨硬化蛋白免疫小鼠,检测小鼠抗血清的活性,发现小鼠产生的抗体与内源性骨硬化蛋白有良好的交叉反应。然后将纯化的p-硝基苯丙氨酸突变型骨硬化蛋白作为疫苗,并在骨质疏松症模型(OVX)小鼠上验证其治疗效果。对小鼠血清成骨标志物以及micro-CT检测,非天然氨基酸突变型骨硬化蛋白疫苗对OVX模型小鼠有明显的治疗作用,与预期一致,为下一步疫苗的安全性评价及优化打下了基础。