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猪链球菌（Streptococcus suis）是一种革兰氏阳性、溶血性兼性厌氧的球菌。可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、支气管炎、多发性浆膜炎、脑炎、流产、败血症、脓肿及猝死；致人败血症、心内膜炎、脑膜炎,感染后遗症包括失聪和关节炎,严重的致人死亡,是一种重要的人畜共患病病原。根据其荚膜多糖抗原性的差异,分为33个血清型（1-31,33,1/2）。其中,2型（Streptococcus suis type2, SS2）是毒力最强、危害最严重、流行最广泛的血清型之一。1998年和2005年分别在我国江苏和四川暴发大规模SS2感染猪和人的公共卫生事件,临床上有高比例的病人出现中毒性休克综合征（STSS）,对养猪业及公共卫生均构成严重威胁,使得猪链球菌感染的相关研究受到高度关注。尽管致病微生物的致病机理各不相同,但是大部分致病菌致病都是利用粘附和侵袭机制穿透宿主细胞屏障,从而逃避机体清除机制。定植是病原菌致病力的关键,在细菌感染并引起疾病的早期发挥重要作用。病原菌的粘附能力是细菌成功定植的关键,黏附素是病原茵重要的毒力因子。链球菌的黏附素分为两大类,其中一类是MSCRAMMS （microbial surface cell recognition adhesion matrix molecule）,能够粘附细胞外基质蛋白（ECM）以及细胞相关的整合素。这类黏附素一般是细胞壁锚定蛋白,含有LPXTG基序。已知的SS2LPXTG锚定蛋白并不多,omp40和MRP在结构上均属于此类蛋白。本研究以SS2可能的毒力因子omp40和MRP为研究对象,通过Western affinity blot、基因缺失系统以及基因芯片研究了omp40在SS2致病中的作用。构建了猪脑组织cDNA文库,用酵母双杂交技术筛选MRP互作的宿主蛋白,以期更深入的了解MRP致病机制。1猪链球菌2型omp40基因的分布及克隆表达omp40基因是通过抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）方法鉴定的SS2可能的毒力基因,尚待深入研究。本文对omp40基因进行序列分析,克隆表达,并检测其在31株猪链球菌中的分布情况,以期进一步阐明其在SS2致病过程中的作用。结果显示：omp40开放阅读框为3000bp,编码1000aa,含有锚定基序LYXTG。Western blot证实其编码细菌胞壁蛋白。BLAST结果显示该蛋白与金黄色葡萄球菌的胶原蛋白结合蛋白Cna有共同的保守区域。在31株SS2菌株中,除了无毒株T15omp40PCR检测为阴性外,其他从病猪体内分离到的菌株均为阳性,而SS1、 SS7、SS9、SS10、SS11、SS12均为阴性。配体印迹结合实验显示,omp40蛋白能与人胶原蛋白I型结合,提示omp40在SS2的致病过程中可能发挥重要作用。2omp40基因缺失株、互补株的构建及特性分析为了进一步研究omp40基因在SS2致病过程中的作用,利用温度敏感型穿梭自杀质粒pSET4s定点敲除SS2ZY05719的omp40基因,构建了omp40基因缺失株△omp40,并通过穿梭载体pSET2构建互补株C△omp40。比较了各菌株在细胞粘附、生物被膜形成能力、毒力以及胶原蛋白粘附能力的差异。试验结果显示,缺失株和互补株具有较好的遗传稳定性,缺失株对HEp-2细胞粘附能力下降30%,生物被膜形成能力是野毒株的0.65倍,在斑马鱼的感染模型中,毒力下降了4倍,对人胶原蛋白I型的粘附显著下降,这些数据表明omp40与SS2的致病性相关。3猪链球菌2型OMP40介导感染小鼠脑微血管内皮细胞研究为了更好的了解OMP40在SS2感染过程中的作用,以小鼠脑微血管内皮细胞为研究模型,将SS2菌株ZY05719以及OMP缺失株分别与小鼠脑微血管内皮细胞共孵育,Trizol处理后小鼠全基因组表达谱芯片（Roche NimbleGen）分析。结果显示,两组不同处理的细胞中有30个基因的表达出现了差异,对这些基因分析显示,这些基因分属于多种功能范畴,包括免疫反应,炎症反应、信号转导等。其中,在omp40基因的存在下,部分趋化因子以及炎症因子的上调使得中性粒细胞趋化,内皮细胞通透性增加,利于细菌透过血脑屏障,表明omp40基因在SS2引发脑膜炎中起到了一定的作用。4猪链球菌2型纤连蛋白及胶原蛋白结合蛋白的筛选纤连蛋白及胶原蛋白是宿主体内的生物大分子,细胞外基质（ECM）的重要组成部分,是病原菌粘附作用的底物。将2-DE gels, Western affinity blot以及MS相结合,对SS2纤连蛋白及胶原蛋白结合蛋白进行筛选。结果显示：共有8个Collagen结合蛋白及15个Fn结合蛋白在转印后的PVDF膜上被鉴定出来。其中,有7个蛋白能够同时结合Collagen及Fn蛋白。SS2纤连蛋白及胶原蛋白结合蛋白的筛选为进一步研究SS2与宿主互作机制奠定了基础。5MRP与猪脑组织互作蛋白的筛选分离纯化猪脑组织mRNA,以5’端生物素标记的Oligo （dT） primer为引物反转录后连接3种读码框的Adapter,层析柱分级纯化,通过BP重组反应分别构建3种读码框的cDNA入门文库,平均滴度为1.662×106CFU/mL,文库总容量为6.648×106CFU,平均插入片段>1kb,重组率为94%。将3种读码框的cDNA入门文库扩增后提取质粒,取等量的质粒通过LR重组反应将入门文库转换为三框表达文库,经测定滴度为1.78×106CFU/mL,文库总容量为7.12×107CFU,重组率为92%,平均插入片段>1kb。结果表明所构建的三框cDNA表达文库具有较高的重组率和库容量,为进一步酵母双杂交筛选与SS2毒力因子MRP互作的宿主蛋白奠定基础。溶茵酶释放蛋白（Muramidase-released protein, MRP）是SS2重要的毒力因子。利用泛素分离酵母双杂交系统,以MRP为诱饵蛋白从猪脑组织cDNA文库中筛选MRP的互作蛋白,探索MRP在SS2致病中的作用。经过诱饵构建、自激活验证、背景及文库筛选等一系列筛选步骤,得到两个与MRP相互作用的阳性克隆,两个基因分别与紧密连接蛋白5（Homo sapiens claudin5,NM001130861）和突触泡蛋白（Homo sapiens VAMP （vesicle-associated membrane protein）-associated protein A,BC002992）基因高度同源。