背景目前缺血性脑血管病已被例为严重威胁人类健康的重大疾病之一，其发病率、致残率、复发率和致死率都很高。目前对该病治疗的研究仍为医学研究的重点。电针作为传统的非药物治疗方法，通过刺激体表穴位以激活体内的保护机制，在改善脑缺血方面的作用肯定，已被广泛应用于临床，但具体机制仍不十分明确。近年研究表明，内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）属于干细胞群，同时存在于幼体和成体中，一方面在胚胎发育阶段参与血管发生，同时能依靠动员、迁移及分化等一系列过程介导出生后的血管形成。脑缺血后尽快恢复缺血周围区血供，能促进缺血后的神经再生及血管新生，有利于功能恢复。但在脑缺血后血管再生机制的研究中，对电针促进脑缺血后EPCs动员、迁移及归巢形成新生血管的机制研究较少。近年已有大量实验证实，PI3K/Akt确实参与EPCs的增殖、迁移、归巢的过程。但对它的下游信号内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的研究相对少见。有研究提示，激活后的PI3K/AKt能使下游信号分子eNOS的Ser1177磷酸化，增加一氧化氮（nitric oxide，NO）生成。NO通过活化MMP-9，完成骨髓EPCs的动员、迁移及归巢。近年的研究表明，干细胞因子（stem cell factor, SCF）是是一种具有多功能的细胞因子，在MMP-9的作用下，通过与其受体c-kit结合介导EPCs动员、迁移、归巢。以往大量报道证实SCF/c-kit通路能促进脑缺血后的神经再生，但关于SCF/c-kit通路在促进血管再生方面的研究很少见。本研究通过制作SD大鼠局灶脑缺血/再灌注模型，并采用穴位电针作为治疗手段，观察电针作用下缺血区大脑皮质eNOSmRNA和蛋白、MMP-9mRNA和蛋白、SCF及其受体c-kit mRNA和蛋白表达的变化规律，探讨在电针干预下eNOS/MMP-9、SCF/c-kit在脑缺血/再灌注后的作用，并进一步探讨电针改善脑缺血、促进脑内血管再生的机制。目的1．探讨SCF/c-Kit通路在大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤后对脑内血管再生的可能作用；2．探讨eNOS、MMP-9在大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤后脑内血管再生中的可能作用；3．探讨电针对大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤后脑内eNOS、MMP-9、SCF、c-Kit蛋白及mRNA表达时空变化规律的影响。方法雄性SD大鼠125只随机分为假手术组（假手术组，n=15）、局灶脑缺血/再灌注组（模型组，n=55）、局灶脑缺血/再灌注加电针干预组（电针组，n=55）。把模型组及电针组分为局灶脑缺血2h再灌注后1d、3d、7d、14d、21d5个亚组。模型组和电针组均用线栓法制作SD大鼠大脑中动脉局灶脑缺血/再灌注模型。电针组取双侧“合谷”穴（LI4）为刺激穴位。采用神经症状学评分评估局灶脑缺血/再灌注大鼠神经功能缺损症状。免疫组化法检测各时间点大脑缺血周围皮质区eNOS、MMP-9、SCF及c-kit蛋白的表达；RT-PCR法检测eNOS、MMP-9、SCF及c-kit mRNA的表达；Western blot法检测eNOS、MMP-9、SCF蛋白的表达。其中SCF、c-kit mRNA及蛋白定量检测选择再灌注3d、7d、14d。MMP-9及eNOS蛋白及mRNA检测选择再灌注1d、3d、7d。结果1．神经症状学评分SD大鼠局灶脑缺血/再灌注及电针干预后，在再灌注1d、3d、7d及14d均可见不同程度的神经缺损症状。再灌注1d、3d，神经症状学评分轻微减少，模型组与电针组比较差异无显著性（p>0.05）；随着缺血再灌注时间的延长，再灌注7d、14d时，大鼠神经功能有所恢复，评分逐渐减少，电针组评分明显低于模型组，差异有统计学意义（p<0.05）。2．局灶脑缺血/再灌注及电针干预对eNOS蛋白和mRNA表达的影响免疫组化、Western blot及RT-PCR结果显示：eNOS阳性细胞表达以缺血侧皮质、海马为主，阳性细胞为神经元及内皮细胞，梗塞周围小胶质细胞和星型胶质细胞也可见胞浆黄染的阳性细胞。假手术组脑组织有少量eNOS蛋白及mRNA表达。模型组eNOS蛋白及mRNA表达于再灌注1d开始增加，3d达峰值。电针组eNOS蛋白及mRNA表达规律同模型组，再灌注1d表达增加，高峰仍在3d，再灌注7d有所下降。与假手术组比较，模型组及电针组各时间点eNOS蛋白及mRNA表达增高显著（P<0.01）。与模型组比较，电针组各时间点eNOS蛋白及mRNA的表达明显上调（P<0.05）。3．局灶脑缺血/再灌注及电针干预对MMP-9蛋白和mRNA表达的影响免疫组化、Western blot及RT-PCR结果显示：缺血侧皮质、海马、侧脑室旁的神经元、内皮细胞、小胶质细胞和星型胶质细胞均可见胞浆黄染的MMP-9阳性细胞。假手术组脑组织可见少量MMP-9蛋白和mRNA表达。模型组MMP-9蛋白及mRNA表达于再灌注1d开始增加，3d达高峰，7d有所下降。电针组MMP-9蛋白及mRNA表达规律同模型组，再灌注1d表达增加，但低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01），高峰仍在3d，且3d、7d的表达明显高于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）。与假手术组比较，模型组及电针组各时间点MMP-9蛋白及mRNA的表达均显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）。4．局灶脑缺血/再灌注及电针干预对SCF蛋白和mRNA表达的影响免疫组化结果显示：在大脑皮质、海马、脑室旁、梗塞周围组织的血管内皮细胞、神经元、神经胶质细胞均可见SCF阳性细胞表达。假手术组可见少量SCF蛋白表达。模型组SCF蛋白表达在再灌注1d增加，到再灌注7d表达到高峰，14d有所下降，21d时仍然降低但仍未回到假手术组水平，各时间点与假手术组比较差异有统计学意义（p<0.01）。电针组SCF蛋白表达规律同模型组，从再灌注1d到21d表达呈单峰样增高，高峰仍在7d。与假手术组比较，各时间点升高显著（p<0.01）。与模型组比较，电针组各时间点SCF蛋白表达增加明显，差异具有统计学意义（p<0.01）。Western blot及RT-PCR检测SCF蛋白及mRNA表达结果显示：假手术组脑组织中有少量SCF蛋白及mRNA表达，与假手术组比较，模型组SCF蛋白及mRNA表达于再灌注3d开始升高（P<0.01），7d上升到最高峰（P<0.01），14d时开始下降（P<0.01）。电针组各时间点SCF的表达规律同模型组且明显高于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）。5.局灶脑缺血/再灌注及电针干预对c-kit蛋白和mRNA表达的影响免疫组化结果显示：假手术组脑组织皮质、海马可见少量c-kit阳性细胞表达。模型组在缺血坏死区周围皮质、侧脑室及周围小血管内皮细胞、海马齿状回的神经元及神经胶质细胞均可见胞浆黄染的阳性细胞。模型组c-kit蛋白表达在再灌注1d开始增加，延迟到7d达峰值，14d开始降低，21d时仍未回到假手术组水平，各时间点与假手术组比较有统计学意义（P<0.01）。电针组c-kit蛋白表达规律及部位同模型组，再灌注1d表达增加，高峰仍在7d；与假手术组比较各时间点升高明显，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，再灌注1d c-kit蛋白表达增加，但差异无统计学意义（P>0.05）；其余时间点均有统计学意义（P<0.01）。RT-PCR结果显示：假手术组有少量c-kit mRNA表达。模型组：再灌注3d显著增加，于再灌注7d达峰值，14d下降，但仍高于假手术组，各时间点与假手术组比较差异显著（P<0.01）。电针组：各时间点与模型组比较c-kit mRNA上升显著，差异有统计学意义（P<0.01）。结论1．电针可能通过促进局灶脑缺血/再灌注大鼠血管再生，改善大鼠神经缺损症状，促进大鼠肢体功能的恢复；2．电针可上调局灶脑缺血/再灌注大鼠脑内eNOS、MMP-9、SCF、c-kit mRNA及蛋白表达；3．电针可能通过上调eNOS、MMP-9的表达，激活SCF/c-kit轴，动员骨髓EPCs到脑缺血区，促进脑缺血后的血管再生；4．SCF/c-kit通路可能参与局灶脑缺血/再灌注大鼠缺血皮质区血管再生，促进脑缺血后的神经功能恢复。