研究目的:在男性恶性肿瘤中前列腺癌占第二位,全世界癌症死亡原因中占第五位,约10%（37.5万例）的男性癌症相关死亡事件是由前列腺癌引起的,这些年来前列腺癌的发病率和死亡率在我国呈现逐年上涨趋势。前列腺特异性抗原（PSA）广泛应用于前列腺癌早期筛查,但其敏感性及特异性存在一定的局限。因此,迫切需要新的生物标记物来更准确地用于前列腺癌的诊断及预测。多组学方法不仅可以更精准预测癌细胞对化疗或免疫治疗的反应,也可以发现更具有诊断或预后价值的生物标记物。INMT在前列腺癌组织中下调,但其具体的机制尚不清楚。对其分子机制的研究可能有助于加深对肿瘤发生和发展的理解,并在癌症治疗中找到新的靶点。FOXA1作为乳腺癌及前列腺癌发病和进展的驱动因素,与激素受体依赖性转录程序相互作用以调节乳腺或前列腺特异性基因表达和疾病进展。前列腺癌广泛靶向代谢组及转录组学联合分析作为本研究的切入点,通过体外和体内实验共同验证INMT抑制前列腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡的生物学功能,证明FOXA1作为转录因子抑制INMT的转录,筛选并鉴定INMT对MAPK、TGFβ和Wnt信号通路的调控。本研究有力地证明了INMT在前列腺癌发生发展过程中的重要作用,并将深入揭示INMT对前列腺癌的分子调控机制。研究方法:1、广泛靶向代谢组技术、广泛靶向代谢组和转录组联合分析技术收集新鲜前列腺标本:30对前列腺癌组织样本及邻近癌旁组织样本、30例良性前列腺增生组织样本、30例新辅助内分泌治疗后前列腺癌组织样本。通过代谢物的鉴定与样本数据的质控分析,筛选出一些有差异的代谢物,从而对样本的代谢物进行相关的功能预测和分析。进一步通过相关性分析、代谢途径富集等生物信息学技术,对前列腺癌代谢组及转录组的分子生物学功能和通路调控机制进行全面系统性分析,构建分子机制的生物学模型。从上述结果中筛选出显著性代谢途径、差异代谢酶及差异代谢产物并对此进行深入实验分析以揭示其生物学机制或临床应用转化。2、生物信息学分析基于TCGA数据资源及GSE46602数据集,分析INMT m RNA表达与临床特征的相关性。通过GSEA分析前列腺癌中与INMT m RNA表达相关的功能级联反应;通过INMT共表达m RNA分析揭示了INMT最显著的生物学和分子功能;通过CIBERSORT、CIBERPORT-ABS、QUANTISEQ等算法进行肿瘤微环境与免疫浸润相关分析。3、利用慢病毒感染技术验证INMT对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响利用INMT过表达慢病毒感染前列腺癌细胞系,应用Western Blot及RT-q PCR实验验证INMT过表达效率。利用Western Blot、RTCA、CCK-8及流式细胞凋亡实验等检测手段进行细胞增殖及凋亡能力的检测。4、裸鼠成瘤实验验证INMT体内的生物学功能利用慢病毒感染技术构建INMT稳定过表达的前列腺癌细胞系,分别进行裸鼠皮下成瘤实验。首先选择4-6周的Balb/c裸鼠右侧腋下注射前列腺癌细胞,观察移植瘤的生长情况,成瘤30天后处死裸鼠,对不同组别肿瘤进行称重。5、FOXA1与INMT的转录调控关系通过UCSC及JASPAR数据库对INMT上游转录因子及结合位点进行预测;转染FOXA1或INMT si RNA后,利用Western Blot及RT-q PCR实验检测INMT及FOXA1表达量的变化,确定FOXA1及INMT上下游关系;通过Ch IP-q PCR实验验证FOXA1与INMT启动子区相结合及转录调控功能。6、INMT过表达后前列腺癌细胞系转录组学变化利用慢病毒感染技术构建INMT稳定过表达的前列腺癌细胞系后进行转录组学分析,鉴定出与阴性对照组相比的差异基因及差异通路,通过Western Blot检测验证其中MAPK、TGFβ和Wnt信号通路变化。7、INMT影响前列腺癌糖基化修饰在前列腺癌细胞系22Rv1和PC-3细胞中分别敲减和过表达INMT后利用O-Glc NAc修饰泛抗体进行检测,证明INMT对糖基化修饰的影响。结果:1、基于广泛靶向代谢组技术、广泛靶向代谢组和转录组联合分析技术,我们发现前列腺癌组织中68种代谢物上调,1种代谢物下调,包括色氨酸代谢在内的多条代谢通路存在差异,其中涉及差异代谢物包括:N-乙酰5-羟色胺、2-（甲酰氨基）苯甲酸、褪黑激素;差异基因为INMT。2、通过生物信息学分析,我们发现前列腺癌中INMT m RNA表达量低于正常前列腺组织。INMT低表达的前列腺癌患者更易出现淋巴结转移、高Gleason评分、高PSA水平、更低的生存收益。INMT在大多数癌症中表达较低,如膀胱尿路上皮癌、浸润性乳腺癌、结肠癌、头颈部鳞状细胞癌和肾嫌色细胞癌。随着INMT表达的增加,肿瘤分期降低、肿瘤纯度降低、ESTIMATE评分增加、免疫评分增加、基质评分增加、免疫反应强度增加、多种免疫细胞和肿瘤微环境成分增加。3、6种前列腺癌细胞系（PC-3、PC-3M、DU145、22RV1、LNCa P及VCa P）中,Western Blot检测发现INMT在前列腺癌细胞系（LNCa P、22RV1及VCa P）中表达量较低,在前列腺癌细胞系（PC-3、PC-3M及DU145）中表达量较高。对PC-3及22RV1细胞系慢病毒感染稳定过表达INMT后,利用Western Blot检测发现PCNA水平下调,Bcl-2水平下调,cleaved-caspase 3水平上调。通过RTCA和CCK-8发现INMT过表达后前列腺癌细胞的增殖能力下降,通过流式细胞仪细胞凋亡检测我们发现INMT过表达后前列腺癌细胞凋亡明显增加。4、裸鼠皮下成瘤实验证明INMT过表达的22RV1及PC-3细胞注射到裸鼠皮下所形成的肿瘤与对照组相比体积更小、肿瘤重量更轻。5、通过UCSC及JASPAR数据库预测FOXA1为INMT上游转录因子,转染FOXA1或INMT si RNA后,利用Western Blot及RT-q PCR实验证实FOXA1为INMT的上游因子;通过Ch IP-q PCR实验验证FOXA1与INMT启动子区相结合并发挥转录调控功能。6、22RV1慢病毒感染稳定过表达INMT后进行转录组学分析,发现与阴性对照相比561个基因表达下调,731个基因表达上调。通过富集通路分析发现INMT与DNA复制、有丝分裂、细胞周期及凋亡等生物学过程明显相关。Western Blot证实INMT过表达后,MAPK通路的磷酸化p38 MAPK（p38 MAPK）显著上调,而p38 MAPK的总量没有显著变化。TGFβ信号通路中的关键因子Smad4的表达显著下调,PC-3细胞系过表达INMT后TGFβ1的表达下调。Wnt信号通路的相关因子（cyclin D1和β-catenin）表达下调。7、在前列腺癌细胞系22Rv1和PC-3细胞中分别敲减和过表达INMT后利用O-Glc NAc修饰泛抗体进行检测,发现敲减INMT后不同分子量蛋白的O-Glc NAc修饰上调,而过表达INMT后不同分子量蛋白的O-Glc NAc修饰下调。结论:前列腺癌中包括色氨酸代谢途径在内的多种代谢通路存在异常。INMT低表达与淋巴结转移、高Gleason评分、高PSA、不良生存获益相关。INMT抑制前列腺癌细胞增殖并促进细胞凋亡,INMT与肿瘤微环境、免疫浸润及药物敏感性相关。FOXA1作为转录因子抑制INMT的转录。INMT影响MAPK、TGFβ和Wnt信号通路,其中对MAPK通路的影响最为显著。INMT可能抑制前列腺癌的蛋白糖基化修饰过程。