[研究背景]粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)又称集落刺激因子3(CSF3),是一种造血细胞因子,在机体内主要由单核/巨噬细胞、内皮细胞以及成纤维细胞等分泌产生,能够促进粒细胞生成,调节粒细胞功能。粒细胞集落刺激因子受体(Granulocyte colony-stimulating factor receptor,G-CSFR)主要表达于所有发育阶段的中性粒细胞表面,能够与G-CSF特异性结合,从而促进粒细胞成熟和分化。在临床上,重组人粒细胞集落刺激因子(Recombinant human G-CSF,rhG-CSF)被广泛用于治疗先天性粒细胞减少症或由化疗导致的骨髓抑制,大剂量的G-CSF能够动员造血干/祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)由骨髓进入外周血,以用于干细胞移植。近年来研究发现,多种肿瘤组织与肿瘤细胞能够产生G-CSF,且G-CSF可能与肿瘤的发生和发展相关。在接受了 G-CSF处理以用于HSPCs动员和收集的健康供体的造血祖细胞中,检测到基因和microRNA表达谱的长期变化,G-CSF可能促进髓系恶性肿瘤的发展;G-CSF能够调节肿瘤神经生成,促进前列腺癌发展;通过促进上皮细胞-间充质转化(EMT)可增强非小细胞肺癌的恶性程度,降低放疗治疗效果。在晚期卵巢癌肿瘤及肿瘤细胞中发现功能性G-CSFR的表达,对G-CSFR阳性卵巢癌细胞给与G-CSF刺激,能够促进卵巢癌细胞的迁移和存活。乳腺癌是女性群体中发病率最高的恶性肿瘤,并且具有很高的死亡率。G-CSF表达水平与乳腺癌细胞转移能力成正相关,并且G-CSF高表达与乳腺癌患者差的预后相关。但是,关于G-CSF调节乳腺癌细胞的生长和转移能力的作用机制,尚有待于系统深入研究。为了继续阐明G-CSF在乳腺癌发展中的病理生理学作用,我们采用两种乳腺癌细胞4T1与4T07,利用CRISPR/Cas9技术对其G-CSF基因进行敲除,研究G-CSF敲除后,乳腺癌细胞恶性行为的变化,并且对其潜在的机制进行探究。本研究不仅解释了 G-CSF在乳腺癌发生和转移过程中起到的重要作用,而且为控制乳腺癌的增殖和转移提供了新的作用靶点。[研究目的]通过抑制小鼠乳腺癌细胞中G-CSF表达,研究G-CSF对乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移等恶性行为的影响,以及荷瘤小鼠中乳腺癌生长和转移过程中G-CSF的作用,并阐释其作用机制。[研究方法]1.在Genebank中查找G-CSF基因序列,设计识别G-CSF基因位点的Oligos,并将其接入质粒构成基因表达载体,对其进行慢病毒包装,构建目的慢病毒载体。2.慢病毒感染4T1与4T07乳腺癌细胞,用4 μg/ml的嘌呤霉素杀死未感染慢病毒的乳腺癌细胞,对细胞进行纯化,单克隆法筛选目的细胞并扩大培养。收集细胞培养上清,检测上清中G-CSF浓度,分析4T1和4T07细胞G-CSF敲除情况。3.建立小鼠移植性乳腺癌模型,成瘤30天后,收集小鼠血清,CBA法检测小鼠血清中G-CSF含量。4.在96孔板内进行细胞增殖实验,将G-CSF的乳腺癌细胞与阴性对照接种于96孔板,3000细胞/孔,培养72 h,三氯乙酸固定60 min,SRB染色15 min,自然晾干,每孔加150μ1Tris-Hcl缓冲液,置于酶标仪中,560nm处测吸光度。5.取对数生长期的乳腺癌细胞,消化成为单细胞悬液,接种于6孔板内,进行平板克隆形成实验,1000细胞/孔,培养14天后,5%戊二醛固定30 min,0.1%结晶紫染色15 min,拍照记录,对形成的集落计数,计算克隆形成率。6.取对数生长期的细胞,消化为单细胞悬液,6孔板内进行软琼脂单克隆形成实验,1X 104细胞/孔,培养21天后,在倒置显微镜下,任意选5个视野,拍照记录,对集落计数并计算克隆形成率。7.96孔板内划痕法测定乳腺癌细胞迁移能力,在形成单层细胞的孔内用200μ1枪头划痕致伤,在划痕后0 h,24 h处对愈合情况镜下观察并拍照记录,使用ImageJ软件测量划痕面积,对伤口愈合比进行计算并比较.。8.Transwell小室法测定乳腺癌细胞迁移能力,上室中加入含有3X104乳腺癌细胞的100 μl无血清培养基,下室加入700 μl 20%血清的RPMI1640培养基,培养8 h后,5%戊二醛固定,并用0.1%结晶紫染色,在倒置显微镜下选取5个视野,拍照记录,并计算相对迁移率。9.在6孔板内,培养乳腺癌细胞至贴壁后,更换不含血清的RPMI1640继续培养36 h诱导其凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡情况,统计比较凋亡率。10.poly-HEMA包被6孔板,悬浮培养乳腺癌细胞,流式细胞术TUNEL一步法检测细胞的凋亡率。11.对BALB/C雌性小鼠原位接种乳腺癌细胞,成瘤后每隔三天测量肿瘤体积并记录,处死小鼠后称量肿瘤质量并拍照记录。肺组织固定制备病理切片,HE染色观察。Bouin氏染液固定完整肺组织,24 h后拍照记录,并对肺部结节进行分级计数,计算总转移数。12.尾静脉注射乳腺癌细胞建立实验性肺转移模型,14天后处死,肺组织固定制备病理切片,HE染色观察,另外取肺用Bouin氏染液固定24 h后拍照,并对肿瘤转移灶进行分级计数,计算总转移数。13.流式细胞术检测4T1和4T07细胞膜G-CSFR的表达,Western blot检测肿瘤细胞内的磷酸化JAK2,Stat3,ERK1/2与Akt水平,检测Stat3,ERK1/2与Akt总蛋白水平,以及Bcl-2,cyclinD1蛋白表达水平。[研究结果]1.根据G-CSF基因序列,在线设计出两种sgRNA,各自合成一对反向互补的Oligos,连接进入质粒载体GV392,序列测通,成功构建目的慢病毒载体。2.对获得的细胞系采用CBA法检测G-CSF表达量结果显示,经目的病毒感染的细胞,在体外培养时,G-CSF表达量与阴性对照细胞相比显著下降,G-CSF表达抑制作用明显,说明成功建立敲除G-CSF基因的稳转细胞系。3.检测移植性乳腺癌荷瘤小鼠的外周血血清中G-CSF含量,结果显示,经G-CSF敲除的乳腺癌细胞移植而形成的荷瘤小鼠,血清中的G-CSF含量与阴性对照组荷瘤小鼠相比,显著降低。4.检测敲除G-CSF基因后乳腺癌细胞增殖能力变化,结果由OD值表示,代表活细胞数,敲除组乳腺癌细胞经过72 h的培养,OD值与对照组相比显著降低,说明G-CSF表达受到抑制后,乳腺癌细胞增殖能力降低。5.检测乳腺癌细胞的平板克隆能力可反映细胞增殖能力,结果显示,敲除G-CSF基因导致乳腺癌细胞在平板中形成克隆数减少,克隆形成率明显下降。6.将乳腺癌细胞在软琼脂中悬浮培养,检测其单克隆形成能力。结果显示,敲除G-CSF基因后,4T1与4T07细胞在软琼脂中形成的集落数显著减少,克隆形成率明显下降。7.对在96孔板内长成单层的细胞划痕致伤。根据其愈合情况评价迁移能力,结果显示,敲除G-CSF基因的4T07与4T1细胞,相同时间点愈合比显著降低。8.Transwell小室法测定细胞迁移能力,结果显示,敲除G-CSF基因后,穿过小室膜的细胞数目降低,迁移率下降。9.对乳腺癌细胞进行无血清饥饿培养,诱导细胞产生凋亡,流式检测凋亡情况并统计凋亡率,结果显示,敲除G-CSF基因,乳腺癌细胞在无血清培养条件下凋亡率明显上升。10.在包被poly-HEMA的悬浮培养板中培养肿瘤细胞,检测其在悬浮状态下的失巢凋亡情况。结果显示,悬浮培养相同的时间,敲除G-CSF基因的乳腺癌细胞失巢凋亡率相对阴性对照细胞,明显上升。11.建立移植性小鼠乳腺癌模型,对肿瘤生长情况和肺转移进行检测,结果显示,由G-CSF敲除肿瘤细胞移植而成的荷瘤小鼠,肿瘤生长速度显著降低,瘤体质量下降,肺部总转移数也显著下降。12.4T1与4T07细胞膜表面表达G-CSFR;Western-blot结果显示,敲除G-CSF基因的4T1与4T07细胞内,JAK2,Stat3,ERK1/2,Akt磷酸化受到抑制,Stat3,ERK1/2与Akt总蛋白水平未发生明显变化,Bcl-2与cyclinDl表达水平显著下降。[结论]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术可以精准敲除G-CSF基因,显著抑制G-CSF在乳腺癌细胞4T1与4T07中的表达,降低了细胞膜G-CSFR的激活,导致细胞中的JAK2-Stat3、ERK1/2、PI3K/Akt等信号通路激活受到抑制,cyclinD1与Bcl-2表达水平降低,从而使肿瘤细胞在体外的增殖能力、迁移能力与抗凋亡能力下降,在体内肿瘤生长速度降低,肿瘤负荷下降,肺转移受到抑制。