食管癌(Esophageal cancer)在全球发病率居第八位,在一些亚洲国家其发病率尤其高。我国是食管癌高发病地区之一,每年平均死亡人数约15万,在癌症致死率中居第5位。由于食管癌早期症状不典型且不明显,许多病人初次诊断即为进展期食管癌,且一半有远处转移,这类病人的食管癌很难完全手术切除或切除后容易复发,化疗药耐药和放射耐受也较常见,尽管食管癌5年总生存率约为20%,但当发生远处转移时,5年生存率可降到4%。因此,开发新型、有效、不易耐药、无毒的化疗药物尤为重要。目前,黄酮类化合物越来越受到人们的重视,广泛存在于柑橘、柠檬等芸香科柑橘属植物中。药用价值高,无明显的毒副作用,可清除自由基、抗氧化、降低血管脆性、改善血管通透性、降低血脂和胆固醇、抗菌、提高机体免疫能力以及诱导肿瘤细胞凋亡等,在防治心血管疾病、肝脏病变以及肿瘤中发挥重要作用。陈皮素(Hesperetin),是天然黄酮类化合物中的一种。已有研究证实,陈皮素参与调控多种肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移侵袭以及耐药等,包括肝癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌等,且对正常细胞无明显毒副反应。多篇文献报道,陈皮素能通过激活线粒体介导的内源性凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡。目前,陈皮素对食管癌生物学行为的影响尚不清楚。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)是食管癌治疗的基础药物,是最常用的尿嘧啶抗代谢药,它能干扰DNA和RNA的合成,诱导细胞凋亡。由于5-FU本身具备的副作用、耐药性限制了其在食管癌治疗中的应用,因此,人们多采用5-Fu与其他药物联合使用的方案、采用改变5-FU剂型的方式或使用辅助药物来提高其用药准确性,使其在临床上得到较好的应用。因此,本课题提出假设:(1)陈皮素能抑制食管癌细胞增殖和侵袭,诱导其凋亡;(2)陈皮素诱导细胞凋亡可能与诱导细胞内活性氧(ROS)积累、激活线粒体介导的内源性凋亡途径有关;(3)由于陈皮素与5-FU诱导细胞凋亡的机制不同,陈皮素可能与5-FU具有协同抗食管癌的作用,能提高5-FU在临床上的疗效及减少其使用剂量。材料和方法1、以食管癌Eca109细胞为研究对象,通过CCK-8法、EdU染色法检测陈皮素对细胞增殖能力的影响,并用GraphPad Prism软件计算增殖抑制率和IC50;通过Hoechst 33258染色法和流式细胞术检测陈皮素对细胞凋亡的影响;运用碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术检测陈皮素对Eca 109细胞周期的影响;应用预铺基质胶的Transwell小室,检测陈皮素对Eca 109细胞侵袭能力的影响;PBS重悬Eca 109细胞,调整细胞浓度为5×107个/mL,在每只裸鼠右后背部皮下接种100μL细胞悬液,待成功构建皮下瘤lwk后,每组裸鼠分别给与生理盐水或不同浓度的陈皮素,每天观察裸鼠的生长情况,治疗期间每隔3d使用游标卡尺测量移植瘤大小,给药21 d后,断椎处死裸鼠,分离出皮下移植瘤,测量瘤体体积和重量,TUNEL染色法检测瘤体肿瘤细胞凋亡率,HE染色检测裸鼠重要脏器是否有远处转移。2、用探针DCFH-DA、JC-1装载Eca 109细胞,检测陈皮素作用后细胞内ROS和线粒体膜电位(MMP)的变化;利用BSO和NAC分别减少和增强细胞内GSH合成后,检测陈皮素对Eca 109细胞增殖、胞内ROS及MMP的影响是否有变化;分离细胞线粒体和胞浆蛋白,通过western blot分别检测细胞色素C(Cyt C)和凋亡诱导因子(AIF)的表达差异。最后,用western blot进一步检测caspase-3、caspase-9、Apaf-1、cysclinD1、BAX、Bcl-2、MMP2、MMP9 等蛋白表达水平的变化。3、用CCK-8法检测陈皮素和5-FU分别单药和联合用药后Eca 109细胞活力的变化,用calcusyn 2.0软件分析陈皮素和5-FU能否协同抑制Eca109细胞增殖;应用Hoechst 33258染色法和流式细胞术检测联合用药对细胞凋亡的影响;通过PI染色和流式细胞术检测细胞周期;western blot检测caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2等凋亡相关蛋白表达差异。最后,构建裸鼠皮下移植瘤,将其随机分为4组,分别单药或联合用药治疗裸鼠,检测陈皮素和5-FU能否在体内协同抑制肿瘤细胞生长。结果1、在相同的处理时间下,随陈皮素浓度增加,增殖抑制效应增强;当作用浓度相同时,抑制效应随作用时间的增加而增强。在陈皮素作用72 h时,IC50为200 μM。在后续实验中,我们将Eca 109细胞分别给与低、中、高(100、200、300 μM)三个浓度的陈皮素处理,EdU染色结果显示,100 μM陈皮素即可抑制EdU的渗入,但与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),当陈皮素浓度增加到200 μM后,渗透抑制率明显增加(P<0.05),在300 μM作用组,抑制率最高(P<0.05)。流式细胞术检测发现200 μM陈皮素作用细胞24 h后,凋亡率从0.9±0.2%增加到26.4±1.2%,细胞周期结果显示,与正常对照组相比,陈皮素处理组G0/G1期细胞所占比例显著增加(P<0.05)。在Tranwell侵袭实验中,陈皮素处理组穿膜细胞数(100 μM:30±2.5/HP;200 μM:18±1.6/HP;300 μM:9±1.1/HP)明显少于正常对照组(50±3.5/HP)(P<0.05),结果显示陈皮素能明显抑制Eca109细胞的侵袭能力。在体内实验中,24只裸鼠均成功构建了皮下移植瘤,随机分为4组,陈皮素组按30 mg/kg.60mg/kg、90mg/kg分别给药,21d后发现不同浓度的陈皮素均能使瘤体体积减小、重量减轻(P<0.05),且抑制率与作用浓度呈正相关,TUNEL染色显示陈皮素处理组具有更高的细胞凋亡率(P<0.05)。组织病理学检查结果示四组裸鼠的各脏器均未见到肿瘤组织远处转移灶。2、人食管癌Eca 109细胞用陈皮素100、200、300 μM三个浓度处理24 h后,用DCFH-DA为探针检测细胞内ROS,与正常对照组相比,陈皮素处理组细胞荧光明显增强(P<0.05),且荧光强度与浓度呈正比,说明陈皮素能促进细胞内ROS的产生。与200 μM陈皮素处理组相比,NAC抗氧化剂预处理Eca 109细胞能减缓ROS增加的程度,而BSO联合处理能进一步促进ROS产生。不同于胞内ROS增加,陈皮素刺激细胞后,胞内GSH含量显著降低(P<0.05),300μM组GSH含量可减少到正常组的1/5,同样,NAC预处理能减轻GSH减少的程度,而BSO使GSH水平降低更明显。用不同浓度NAC/BSO干扰Eca 109细胞后,CCK-8法检测200 μM陈皮素对Eca 109细胞活力的影响,结果显示NAC预处理对Eca 109细胞起保护作用,且与NAC浓度呈正比;而BSO共处理会加重陈皮素对Eca 109细胞的毒性作用,BSO浓度越高,细胞毒性作用越强。进一步用JC-1探针检测细胞内MMP,结果提示随着陈皮素浓度增加,细胞内的红色荧光逐渐减弱,而绿色荧光逐渐增强,红色/绿色荧光比值降低明显(P<0.05),说明陈皮素能刺激细胞内MMP降低,且NAC预处理能减轻MMP降低的程度,而BSO则起相反的作用。western blot结果为陈皮素使线粒体内的CytC和AIF表达减少,而胞浆内CytC和AIF表达增加,活化的casμase-9 和 casμase-3、BAX、sufu 表达上调,Bcl-2、survivin表达下调。此外,陈皮素刺激还使金属蛋白酶MMP2、MMP9表达减少。3、陈皮素在25～800 μM范围内、5-FU在2.5～80 μM浓度范围内对人食管Eca 109癌细胞生长均具有明显的抑制作用。与单药处理组相比,陈皮素与5-FU按浓度比10:1联合作用Eca109细胞后,CCK-8法示联合用药能协同抑制细胞生长,Hoechst 33258染色显示联合用药组可见最多的亮蓝浓缩核,流式测细胞凋亡示联合用药组凋亡率(38.25±4.52%)明显大于单药处理组(200 μM陈皮素:21.38±3.35%;20 μM 5-FU:13.91±2.16%)(P<0.05),流式检测细胞周期示联合用药组G0/G1期细胞比例增明显增加(70.64±5.65%),高于单药处理组(2000μM陈皮素:63.1±4.81%;20μM5-FU:58.87±1.53%),差异具有显著性(P<0.05)。western blot检测发现与单药处理组相比,在联合用药组活化的caspase-9和caspase-3、BAX表达上调,而Bcl-2、cyclinD1表达下调。在裸鼠体内实验中,24只裸鼠均成功构建了皮下移植瘤,随机分为4组,分别给与生理盐水、5-FU10mg/kg、陈皮素60mg/kg、5-FU10mg/kg +陈皮素60 mg/kg,治疗21d后发现,各组裸鼠体重、肝肾功能无明显差异,但是瘤体体重有显著差异(对照组:0.915±0.144g;5-FU组:0.553±0.021g;陈皮素组0.443±0.033 g;联合用药组:0.273±0.045g),联合用药组瘤体体积最小,与单药用药组和对照组比较均有显著差异(P<0.05)。TUNEL染色亦显示与单药用药组相比,联合用药组的细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。结论陈皮素能抑制人食管癌Eca 109细胞增殖和侵袭,通过诱导细胞内ROS增加和GSH耗竭,激活线粒体介导的内源性凋亡途径引起细胞凋亡。另外,陈皮素能协同5-FU诱导Eca 109细胞凋亡。