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兰科(Orchidaceae)植物是单子叶植物中具有较高观赏价值和药用价值的一大类,同时也被视为珍稀濒危植物。在自然条件下,兰科植物在整个生命周期均依赖于兰科菌根(OM)形成而获取不可或缺的营养,但OM形成的分子机理却鲜有报道。本研究小组前期通过对大花蕙兰(Cymbidium hybridum)菌根诱导的转录组数据进行分析,从中挖掘出受菌根真菌特异诱导表达的基因信息。本论文选取其中可能与糖转运相关的SWEETs基因以及与核苷转运相关的ENT和PUP基因,对其受不同菌根真菌种类诱导的表达特性及亚细胞定位、转运活性进行初步研究,以期为进一步阐释这些基因在OM菌根形成中的功能打下基础。本论文主要研究结果如下:(1)基于大花蕙兰菌根诱导的转录组数据,从中挖掘出受诱导表达的类PUP基因CyPUP3及类SWEET基因(CySWEETs:CySWEET4a,CySWEET4b,CySWEET14),对这几个基因进行克隆并测序比对,证明这些基因的组装EST序列真实可靠,可以用于后续研究。(2)对CyPUP3、CySWEETs进行蛋白质跨膜预测及系统发育树分析表明,这些基因的氨基酸序列都具有典型的同源基因的跨膜域,其中,CyPUP3具有10个跨膜域,与AtPUP3和OsPUP3同源性分别达到44.47%和48.81%;而CySWEETs则有7个跨膜域,其中CySWEET4与水稻OsSWEETs中的OsSWEET4的同源性达到59.07%,C ySWEET14与拟南芥AtSWEET11-14同源性均达到50%以上。(3)半定量和qPCR试验结果表明,CyENT3基因以及CyPUP3、CySWEETs基因不仅受瘤菌根菌(Epulorhiza repens)ML01的诱导表达,而且还受印度梨形孢(Piriformosporaindica)的诱导,这些基因受这两种菌的诱导表达模式基本一致。(4)通过Gateway系统构建了CyPUP3的瞬时表达载体,并转入本氏烟草(Nicotiana benthamiana)进行瞬时表达,观察到其表达蛋白定位在原生质膜上,结合其与已知功能的AtPUP3具有高度同源性,推测其具有跨膜转运活性。(5)通过转化缺失内源核苷转运系统的酿酒酵母突变菌株BYL042c,在含核苷的缺陷型培养基上培养发现,与对照组相比,转化了CyENT3的酵母能在含腺苷的培养基上生长而不能在有毒的5-氟尿嘧啶核苷的培养基上生长,这一试验结果表明CyENT3的确能够有效地转运核苷。(6)CySWEET4a和CySWEET4b属于SWEET家族II型成员。利用敲除了单糖转运蛋白的酿酒酵母突变体EBY.VW4000,通过设计不同的碳源培养基以验证其转运功能。试验结果表明,转化了CySWEET4a或CySWEET4b的酵母能在含有葡萄糖的培养基上生长良好,而对照组的长势很弱,这一试验结果表明CySWEET4a和CySWEET4b都具有够转运葡萄糖的功能。