研究背景和目的自噬是细胞适应内在和外在多种不同应激的的一种手段。通过这种自我相食的过程,细胞内的各种成分被吞噬在双层膜的自噬体内,继而被转运到溶酶体中进行降解和再循环,而自噬的末期阶段是指当自噬体被循环利用后通过自噬溶酶体重构(autophagic lysosome reformation,ALR)的途径重新形成溶酶体。在很多生理和病理的过程中,细胞成分的降解和回收都需要依靠自噬来调节,因此自噬对于维持各种组织及细胞的稳态起到了非常重要的作用。表皮可以保护机体免受外界的侵害,防止机体脱水的发生,这两点对于机体生存来说都是必不可少的,而自噬对于维持表皮的稳态和屏障功能起到了至关重要的作痛。例如,自噬可以降解代谢的细胞器(如线粒体、高尔基体、内质网等)和细胞核,对于人体表皮角质形成细胞的正确终末分化有极其重要的意义。许多研究认为,表皮细胞的核滞留与自噬功能的破坏有很大的关系,其是很多皮肤疾病的特征性改变。然而,我们现在只了解自噬作用对于表皮细胞在生理方面可以起到重要作用,但关于在表皮细胞中如何调节自噬的分子途径却知之甚少。MicroRNA(下称miRNA)是一类调控性非编码小RNA,是上皮细胞稳态和应激反应的重要调节因子。miR-103/107属于miRNA家族,二者具有相同的种子序列,仅有一个在种子序列外部的3’核苷酸不同,因此,miR-103/107往往靶向共同的基因。我们在前期的研究中已经证明,miR-103/107家族在干细胞富集的角膜缘上皮中表达较高,并且调节原代人角膜缘上皮角质形成细胞(human limbal epithelial keratinocytes,HLEKs)中的细胞周期、增殖能力和细胞与细胞之间的通信。我们的体外研究发现,miR-103/107在HLEK细胞中通过维持发动蛋白(dynamin)的活性来调节自噬的末期阶段。具体来讲,miR-103/107的缺失增加了磷酸化的发动蛋白(p-dynamin),即dynamin的无活性形式,进而导致自噬的末期阶段被抑制。那么,miRs-103/107是否可以以类似的方式在体内调节自噬的末期阶段呢?miRs-103/107是否参与了其他复层上皮细胞(比如表皮细胞)的自噬?本课题将展示在小鼠表皮中,miRs-103/107如何在体内通过调控发动蛋白的活性来正向调节自噬的末期阶段。方法:1.使用20nM锁核酸(locked nucleic acid,LNA)修饰的地高辛标记的探针对miR-103和miR-107进行原位杂交。2.构建系统表达GFP与LC3融合的GFP-LC3转基因小鼠模型,将该转基因小鼠或野生型小鼠(BALB/c)的皮肤样品解剖分离并埋入OCT冰冻切片中,进而使得小鼠皮肤中的miR-103/107表达可视化。3.将皮肤样品溶解在Qiazol中,获得小鼠总细胞RNA。用antagomir-107和antagomir(对照)处理皮肤,然后通过miRNeasy试剂盒分离和纯化总细胞RNA,进行实时qPCR检测。4.将氯喹溶解在PBS中腹膜内注射,测量体内自噬通量。5.使用Antagomir和MicroRNA模拟物进行小鼠皮下注射,收集注射部位用于进一步的实验。6.将小鼠皮肤OCT样品切片,镜下观察GFP-LC3斑点,并使用ImageJ对GFP斑点进行计数。7.用免疫染色的方法可视化小鼠皮肤组织的p62蛋白、磷酸化发动蛋白、发动蛋白、LAMP1、角蛋白10、角蛋白15和兜甲蛋白等,采集和分析图像,并测量相对荧光密度。8.利用western blot检测miR-103/107的抑制或过表达后信号通路的改变以及自噬标志物表达的变化,如LC3B、PLD1、PLD2、角蛋白10、桥粒核心糖蛋白1、发动蛋白和p62等。9.使用倒置光学显微镜在室温下观察并记录HEK细胞的空泡受到抑制或过表达miR-103/107的影响,计算每个细胞的空泡数目。并通过抑制PKC或CDK5途径验证miR-103/107对自噬末期阶段调节的途径。10.使用HEK细胞进行体外western blot及免疫荧光试验,验证miR-103/107通过何种途径调节自噬的末期阶段。11.进行不成对的t检验以确定统计学显着性。数据显示为平均值±标准偏差(SD)。p值<0.05时,差异被认为是显着的。所有实验至少重复三次。结果:1.miRs-103/107家族正向调节表皮细胞的自噬我们在以往的研究中发现,miR-103/107在调节HLEK细胞自噬末期阶段的方面发挥了积极的作用。为了进一步研究miR-103/107在自噬中发挥的作用,我们利用原位杂交来定位miR-103/107在小鼠皮肤中的表达,发现miR-103/107在表皮和毛囊中表达,但不在真皮中表达。在表皮中,miR-103/107在基底层和基底上层高度表达,而在末端分化的表皮层中低表达。这种表达模式与我们在角膜缘上皮中观察到的相类似,其中miR-103/107出现在基底层和基底上层。我们利用转基因技术构建了表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的LC3(GFP-LC3)小鼠模型,这是一种完善的用于检测自噬的小鼠模型。LC3则是一种被广泛应用的自噬标志物,在自噬的早期阶段,LC3与磷脂酰乙醇胺结合并募集至自噬体膜,进而形成自噬体。我们分别使用对照组antagomir和实验组antago-107皮下注射GFP-LC3小鼠,其中antago-107可以抑制内源性的miR-107。qPCR的结果表明,在注射完成的1天或2天之后,antago-107在小鼠表皮中耗尽了内源性miR-107。而为了明确这种处理对自噬状态的影响,我们在表皮中成像并测量了 GFP-LC3斑点数量。与对照相比,已注射antago-107小鼠的表皮基底层中自噬体显著累积,即出现了更多的GFP-LC3斑点。此外,免疫印迹试验也证明了 antago-107的处理会导致GFP-LC3转基因小鼠中的GFP-LC3蛋白和野生型小鼠中的内源性LC3蛋白的积累。自噬是一个动态的细胞过程,因此我们需要确定自噬的通量。p62蛋白是一种被广泛接受的自噬相关蛋白,其表达与自噬通量呈负相关的关系。通过免疫染色和免疫印迹试验,我们检测到内源性miR-107的消耗显着增加了小鼠表皮中p62蛋白的表达水平,证明miR-107的抑制降低了自噬通量。LC3周转分析是确定自噬通量的另一个公认方法,我们将注射了 antago-107的GFP-LC3小鼠用溶酶体抑制剂氯喹处理后发现,antago-107并不能进一步增加GFP-LC3,这表明GFP-LC3在缺乏miR-107表皮中的积累是由于自噬末期阶段的抑制,而不是源于自噬早期阶段的缺陷,这与我们在体外观察到的结果相一致,这些结果均表明miR-103/107家族参与了体内的自噬调节且发挥了重要的作用。miRNA模拟物是化学修饰的双链RNA,可以模拟内源性的miRNA,将该miRNA模拟物导入小鼠体内可以上调相应miRNA的活性。为了进行功能获得性研究,我们使用了体内转染的方法将miR-107模拟物皮下递送至小鼠皮肤。与前面的试验结果一致,用miR-107模拟物处理的小鼠皮肤中,表皮基底层中的GFP-LC3斑点和p62免疫荧光均减少了,证明miR-107可以增强表皮中的自噬通量。有研究认为,自噬在表皮颗粒层的终末分化过程中也起到了重要的作用。然而,免疫印迹和免疫染色试验结果显示,antago-107或miR-107模拟物的处理对角蛋白10(keratin 1)、桥粒核心蛋白1(desmoglein 1)和兜甲蛋白(loricrin)(三种细胞分化的标志物)的表达并没有显着影响。2.miR-103/107家族正向调节表皮中发动蛋白的活性近年有研究表明,发动蛋白的活性对于溶酶体重构以及溶酶体清除都是十分必要的,发动蛋白一旦磷酸化即失去活性,将导致自噬末期阶段的抑制。我们在以往的研究中已经证实,在HLEK细胞中antagos-103/107的处理会上调磷酸化的发动蛋白,导致了自噬的抑制。因此,我们在用antago-107处理后,在表皮中用免疫组化的方法来检测磷酸化发动蛋白的表达水平,我们发现,通过注射antago-107删除内源性miR-107后,磷酸化的发动蛋白显著增加了,但总发动蛋白(total dynamin)并没有明显变化,这表明antago-107抑制了发动蛋白的活性。同时,免疫印迹也显示小鼠表皮中miR-107的丢失显着上调了磷酸化发动蛋白。相反,我们通过体内转染miR-107模拟物下调了小鼠表皮中发动蛋白的磷酸化,同样也并不影响总发动蛋白水平。总的来说,这些结果表明miR-103/107家族在体内对发动蛋白的活性具有积极的激活作用,进而促成了适当的细胞自噬末期阶段。3.miR-103/107家族通过靶向PKC途径来调节自噬的末期阶段为了探索在干扰miR-103/107后自噬机制如何改变,我们使用antagomir处理并抑制了培养的人表皮角质形成细胞(human epidermal keratinocytes,HEK)中的内源性miR-103/107。在以往的研究中我们已经证明,在HLEKs细胞中miR-103/107的缺失会抑制自噬的末期阶段,从而导致细胞中大空泡的积聚。与此相一致,我们发现在HEK细胞中使用antagos-103/107处理,也同样诱导出了大量的空泡。自噬是一个多阶段的过程,因此我们需要了解哪个阶段的自噬会被miR-103/107的缺失所抑制。在此,我们使用了核内体酸化抑制剂氯喹(chloroquine,Chlo)和空泡型质子泵抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,BafA1),分别通过破坏自噬溶酶体的形成来抑制自噬。我们发现,氯喹和巴弗洛霉素A1的使用都使得antagos-103/107处理过的HEK细胞空泡减少了,这表明空泡积累是需要正确的自噬溶酶体形成的,因此可以证明miR-103/107的缺失抑制了自噬的末期阶段。我们以往的研究表明,在HLEK细胞中miR-103/107是通过蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和细胞周期依赖性激酶 5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5)途径调节发动蛋白活性,从而调节自噬的末期阶段的。于是我们想知道在HEK细胞中,抑制PKC和CDK5途径是否可以挽救并减少用antagos-103/107处理后的细胞空泡累积——结果显示两种PKC抑制剂Ro-32-0432和咖马林(Rottlerin)的处理都减少了 antagos-103/107处理的HEK细胞中的空泡形成。然而,与用antagos-103/107单独处理的HEK相比,用CDK5抑制剂Roscovitin处理后,空泡的形成并没有显着的变化。总的来说,这些结果表明PKC途径参与了 HEK细胞中miR-103/107介导的自噬末期阶段,而CDK5途径并没有参与。4.miR-103/107家族通过PLD1/PLD2/PKC途径调节发动蛋白活性我们在以往的研究中已经证实,HLEK细胞中miR-103/107的缺失可以上调PLD1和PLD2,从而激活PKC,导致磷酸化发动蛋白的增加,以及发动蛋白与自噬溶酶体的解离。为了证明同样的调节是否发生在皮肤表皮中,我们用antagos-103/107和ir-antago(对照)来处理HEK细胞。与之前的结果相一致,HEK细胞中miR-103/107的丢失:(1)上调了它们的直接靶点PLD1和PLD2;(2)增加了磷酸化发动蛋白;(3)减少了发动蛋白和溶酶体相关膜蛋白1(lysosome associated membrane protein 1,LAMP 1)的共定位。为了验证miRs-103/107是否通过PKC途径调节发动蛋白活性,我们再次使用了 PKC抑制剂Ro-32-0432和Rottlerin来处理HEK细胞。在用antagos-103/107处理的HEK细胞中,PKC的抑制减少了磷酸化的发动蛋白,表明PKC对于antagos-103/107诱导的发动蛋白磷酸化是必需的。结论:MicroRNA-103/107家族是通过PLD1/2-PKC-发动蛋白通路调节小鼠体内表皮细胞的自噬末期阶段,在整个自噬过程中具有关键性的作用。