论文部分内容阅读
亲吻素(Kissl)和卵泡刺激素受体(Follicle Stimulating Hormone Receptor, FSHR)基因对产仔数有显著影响,在家畜繁殖生理学领域占有重要地位。Kissl是公认的下丘脑促性腺激素释放激素(Gonadotropin Releasing Hormone, GnRH)上游重要调控因子,在性腺轴系统中起中枢节点的作用,能直接作用于GnRH神经元,刺激GnRH的分泌,激活性腺轴,并且在发情周期内正向调控黄体生成素(Luteinizing Hormone, LH)和卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)的分泌。在雌性哺乳动物中,卵泡刺激素的主要作用是促进性腺发育和维持正常的生殖功能,促进卵巢中卵泡的生长、卵泡颗粒细胞的增生和雌激素的合成与分泌,刺激卵泡细胞上LH受体的产生。它对卵泡生长发育和成熟分化起重要调控作用,直接影响卵泡发育的数量和质量,而FSHR是FSH发挥生理功能不可或缺的重要因素。本文旨在探究Kissl和FSHR基因与繁殖功能之间的关系,以猪的Kissl和FSHR基因为研究对象,将构建的小鼠脑部特异表达的真核载体pCaMKIIa-Kissl和小鼠卵巢颗粒细胞表达的AMH-pFSHR真核载体线性化处理后,显微注射入小鼠受精卵以制备转基因小鼠。通过Southern blot方法统计转基因小鼠阳性率；利用Genome Walking确定外源基因的插入位点；统计转基因阳性小鼠及其后代的产仔数性状,从而验证这两个基因能否促进卵泡发育和成熟,为提高猪的后代产仔数提供新思路。主要实验结果如下：1.利用PCR扩增出猪Kissl基因的CDS区,并将其克隆到pMD19-T载体上。酶切和测序结果显示pMD19-T-Kissl载体构建正确,与公布的猪Kissl基因CDS区同源性达到100%。将Kissl基因插入表达载体pCaMKⅡ,酶切和测序结果表明pCaMKⅡα-Kissl构建正确。2.利用显微注射的方法将线性化处理的pCaMKⅡα-Kissl和AMH-pFSHR片段分别注入小鼠受精卵中,制备转基因小鼠。通过提取基因组DNA,利用PCR法对获得的71只GO代转pKissl基因小鼠检测,发现4只表现为阳性,阳性率为5.63%(4／71)。将PCR阳性个体经过Southern blot鉴定获得4.22%(3/71)的阳性率。43只转pFSHR基因GO代小鼠,通过PCR法检测后获得9个阳性个体,转基因阳性率为20.93%(7/43),随后将PCR阳性个体进行Southern blot验证,最终获得6.97%(3/43)的阳性率。3.利用Genome Walking对获得3个转基因阳性小鼠进行Kissl基因定位分析发现,其中一个个体有两个插入位点。采用同样的方法对3个转pFSHR基因小鼠定位时发现,每个个体都只有一个插入位点。4.将GO代阳性个体与阴性母鼠交配获得F1代小鼠,经过PCR水平的检测,最终确定阳性率为43.05%(65/151)。转pKissl基因的小鼠在F1代表现出产仔数增多的趋势。同期转pFSHR基因F1代阳性个体与阴性种公鼠交配获得F2代小鼠,经过PCR水平检测,最后获得29.33%(22/75)的阳性率。转pFSHR基因小鼠具有产仔数多且后代成活率高的趋势。