研究背景在我国乃至全世界范围内,腰痛始终在威胁人类的健康。腰痛一直是骨科的常见病,并影响了很多人的正常生活和工作。据美国国家卫生统计中心的资料表明大约超80%的人一生中会遭遇腰痛的烦恼。对于老年人来讲,腰痛是限制老年人活动的最主要原因。虽然导致腰痛的确切病因到现在为止还并不清楚,但人们普遍接受的一个病因是椎间盘的增龄性改变。随着年龄的增长,椎间盘逐渐发生退变,而且退变的速度也在逐渐加快,尤其是腰椎的退变是导致椎间盘源性腰痛的主要原因。目前,普遍认为人类在二十岁左右椎间盘就开始发生退变,椎间盘退变要比脊柱的其他结构的退变发生的更早,最早发生退变的是髓核,髓核的改变包括蛋白多糖聚合物的降解断裂,脱水和活性细胞的丢失,以往研究认为导致椎间盘退变的因素包括随着年龄的增长,椎间盘的体积增加,从而导致髓核的营养通路变长和营养物质的供给不足。而且椎间盘是无血运组织,位于椎间盘周围的纤维环由胶原组成,而位于椎间盘中心的髓核则富含蛋白多糖,随着年龄的增长,蛋白多糖明显减少,蛋白多糖的减少被认为是椎间盘退变的关键因素。生活在有氧环境中的生物体,不可避免的会遭受活性氧的侵害,而且这种侵害是持续的。所谓的活性氧并非单一分子,而是一系列不同种类的小分子,其中包括超氧负离子,羟基和过氧化氢等。有些活性氧是极其不稳定的,如超氧负离子和羟基,而另外一些如过氧化氢是较稳定且可以自由扩散的。自由基可以是外源性的也可以是由细胞内部产生的。活性氧产生过多和抗氧化系统之间的失衡就产生了氧化应激。抗氧化酶可以特异性的清除氧自由基,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是第一个被发现的抵抗氧化应激的酶。抗氧化酶包括两种超氧化物歧化酶,铜-锌超氧化物歧化酶位于胞浆中,锰超氧化物歧化酶位于线粒体中。氧化应激的一个重要特征是脂质过氧化反应,氧自由基攻击细胞膜的脂质双分子层,产生大量的反应产物。丙二醛是其中的一个反应产物,已经作为氧化应激的一个重要标志物。现在,人们逐渐开始认识到蛋白的氧化在很多退变性疾病的发生发展中发挥了重要作用,在这一过程中发现了许多反应氧化应激状态的蛋白氧化标志物。晚期氧化蛋白产物就是其中之一近年来得到较多的关注。通常认为当氧自由基的产生与清除之间的平衡被打破时就会出现氧化应激。这种平衡被打破的原因可能来自体内也可能来自体外,而由此导致的损伤是细胞衰老的主要原因,细胞通过一系列的抗氧化系统抵制自由基来保护自己,细胞外的抗氧化系统也参与抵制和减轻氧化损伤。衰老是一个多因素作用的过程,氧化应激与衰老之间存在重要联系,衰老是导致椎间盘退变的一个重要因素,但是目前对于自然老化的大鼠椎间盘氧化应激状态并不清楚,因而本文拟研究自然老化的大鼠椎间盘氧化应激状态。目的研究自然老化的大鼠椎间盘氧化应激状态,揭示椎间盘增龄性改变与氧化应激之间的关系,并探讨氧化应激在椎间盘增龄性改变中的作用。方法1、实验用清洁级雄性纯种健康wistar大鼠(国家A级实验动物,南方医科大学动物实验中心提供)60只,其中青年组大鼠(3月龄)20只,成年组大鼠(9月龄)20只,老年组大鼠(18月龄)20只,采取动脉血,离心后留血清,切取椎间盘组织,制成组织匀浆。2、每组选5例做组织学检测：脱钙,脱水后作运动节段正中矢状切片,用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)以及番红-固绿(safranin O-fast green)进行椎间盘标本染色,并根据显微镜下观察结果进行组织学评分。3、组织学评分：分为5项,每项1-3分,最高为15分,最低为5分。分别为纤维环的细胞组成,纤维环形态,纤维环与髓核交界区,髓核的细胞组成,髓核的形态。4、生物化学检测：采用硝酸还原法检测椎间盘组织匀浆及血清中一氧化氮(Nitrogen monoxide, NO)的含量；采用黄嘌呤氧化酶法测定椎间盘组织匀浆及血清中超氧化物歧化酶活力；采用硫代巴比妥酸(TBA)法检测椎间盘组织匀浆及血清中丙二醛(Malondialdehyde, MDA)的含量；采用分光光度法测定血清及椎间盘组织中晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products, AOPP)的含量。5、统计分析：采用SPSS13.0统计软件进行分析。所得数据均采用均数±标准差(X±S)表示。多组数据比较采用单因素方差分析,组间多重比较,采用LSD法,P<0.05为具有统计学意义。结果1、组织学检测发现青年组大鼠椎间盘内,完整的近圆形的髓核占据椎间盘50%以上的区域。星状的髓核细胞均匀的分布于髓核中,纤维环排列规则,各层纤维软骨板呈同心圆状分布,没有断裂,成纤维细胞分布其间。成年组大鼠椎间盘出现一定程度的退变,髓核呈圆形或不规则形,在椎间盘内占据的区域少于1/2,但多于1/3。髓核细胞的数量减低,部分成簇分布,纤维环向内膨出、皱缩或破裂的纤维环低于纤维环的1/3。成纤维细胞或软骨细胞比例均低于75%,纤维环与髓核轻度分离。老年大鼠椎间盘进一步退变,髓核细胞数量进一步减少,残余细胞成簇分布,髓核形态不规则,纤维环中软骨细胞比例增大,破裂皱缩的纤维增加,纤维与髓核重度分离。方差分析三组椎间盘评分有统计学差异(F=42.818,P=0.000),组间多重比较提示：青年组评分显著小于成年组和老年组(P=0.000；P=0.000),成年组显著小于老年组(P=0.002)。2、氧化应激指标检测：(1)NO检测结果通过硝酸还原酶法,测定OD值经公式计算可得到大鼠血清及椎间盘组织匀浆中NO含量。青年组大鼠血清中NO含量为15.1403±3.9712μmol/L,椎间盘匀浆中的含量为18.6357±16.3681μmol/gprot；成年组大鼠血清中NO含量为15.8841±4.3315μmol/L,椎间盘匀浆中的含量为37.7185±20.6398μmol/gprot；老年组大鼠血清中NO含量为16.0915±4.8031μol/L,椎间盘匀浆中的含量为49.1593±28.7779μmol/gprot。随着年龄的增长,大鼠血清中NO的含量逐渐增加,但青年组、成年组及老年组三组之间差别不显著(F=0.261,P=0.771)。椎间盘匀浆中NO含量逐渐增高,有显著差异(F=9.374,P=0.000)。组间多重比较：椎间盘组织匀浆中NO含量老年组和成年组均显著高于青年组(P=0.000;P=0.010),老年组与成年组之间无显著差异(P=0.114)。(2)SOD检测结果通过黄嘌呤氧化酶法测定大鼠血清及椎间盘匀浆中超氧化物歧化酶活力：青年组大鼠血清中SOD活力为187.6387±6.4206U/ml,椎间盘匀浆中的SOD活力为98.5516±24.8518U/mgprot；成年组大鼠血清中SOD活力为182.2228±5.5937U/ml,椎间盘匀浆中的SOD活力为86.5944±26.8894U/mgprot；老年组大鼠血清中SOD活力为179.9398±6.9553U/ml,椎间盘匀浆中SOD活力为69.2931±25.9436U/mgprot。随着年龄的增长,大鼠血清中SOD的活力有逐渐下降趋势。总体讲,三组之间存在统计学差异(F=7.777,P<0.001)。组间多重比较：青年组显著高于成年组及老年组(P=0.009；P=0.000)。成年组与老年组之间无显著差别(P=0.114)。椎间盘匀浆中SOD活力逐渐减低,有显著差异(F=6.448,P=0.003)。组间多重比较：椎间盘组织匀浆中SOD活力老年组显著低于青年组和成年组(P=0.001；P=0.039),青年组与成年组之间无显著差异(P=0.150)。(3)通过硫代巴比妥酸(TBA)法检测大鼠血清及椎间盘内MDA含量,青年组大鼠血清中MDA含量为6.7615±2.2892nmol/ml,椎间盘匀浆中的含量为5.4613±3.7687nmol/mgprot;成年组大鼠血清中MDA含量为8.3463±2.7170nmol/ml,椎间盘匀浆中的含量为6.2193±4.1821nmol/mgprot;老年组大鼠血清中MDA含量为12.1078±2.4669nmol/ml,椎间盘匀浆中的含量为8.9931±4.8440nmol/mgprot。随着年龄的增长,大鼠血清中MDA浓度有逐渐增高的趋势。总体讲,三组之间存在统计学差异(F=24.184,P=0.000)。组间多重比较：青年组显著低于成年组及老年组(P=0.050；P=0.000)。成年组显著低于老年组(P=0.000)。椎间盘匀浆中MDA浓度逐渐增高,有显著差异(F=3.760,P=0.029)。组间多重比较：椎间盘组织匀浆中MDA浓度老年组显著高于青年组和成年组(P=0.012；P=0.045),青年组与成年组之间无显著差异(P=0.578)。(4) AOPP检测结果通过分光光度法测定大鼠血清及椎间盘组织匀浆中晚期氧化蛋白产物的含量,青年组大鼠血清中AOPP含量为37.2310±8.9431μmol/L,椎间盘匀浆中的含量为55.7073±21.2910μmol/mgprot;成年组大鼠血清中AOPP含量为69.2388±17.2419μmol/L,椎间盘匀浆中的含量为93.3990±25.3464μmol/mgprot;老年组大鼠血清中AOPP含量为82.9855±20.2328μmol/L,椎间盘匀浆中的含量为107.4738±33.0502μmol/mgprot。随着年龄的增长,血清和椎间盘组织中AOPP的含量呈增加趋势,血清中三组之间差别有统计学意义(F=42.040,P=0.000),椎间盘组织匀浆中三组之间也有统计学差异(F=19.645,P=0.000)。组间多重比较：血清中AOPP含量老年组和成年组均显著高于青年组(P=0.000；P=0.000),老年组与成年组之间有显著差异(P=0.009)；椎间盘组织均浆中AOPP含量老年组和成年组均显著高于青年组(P=0.000；P=0.000),老年组与成年组之间无显著差异(P=0.105)。结论1、随着年龄的增长,自然老化大鼠椎间盘组织发生增龄性改变。2、自然衰老大鼠椎间盘发生了氧化应激,氧化应激在椎间盘增龄性改变的过程中可能发挥重要作用。