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研究背景糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy, DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一,是成人失明的重要病因。血-视网膜屏障损伤和血管新生是DR的主要病理特征。其中,血-视网膜屏障损伤不仅是非增殖性DR(DR分为非增殖性DR和增殖性DR)的重要病理特征,而且是导致非增殖性DR向增殖性DR转变的关键步骤,因此,减轻或抑制DR血-视网膜屏障损伤对于DR防治非常重要。但目前仍无有效的措施干预并延缓糖尿病视网膜微血管屏障损伤的发生发展。非对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine, ADMA)是内源性一氧化氮合酶抑制物,在体内主要由二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase, DDAH)水解。我们实验室和国内外其他学者均已证明在糖尿病和糖尿病血管并发症时,ADMA水平的升高与血管内皮功能紊乱和血管病变密切相关。然而,有关DDAH/ADMA与糖尿病血管病变的研究主要集中在外周血管,是否与糖尿病微血管病变有关,报道甚少。临床研究发现,DR病人血浆ADMA浓度明显升高,且其房水中ADMA水平亦显著增加,提示ADMA可能在DR的发生发展中起了重要作用。已知,间隙连接细胞间通迅(Gap junction intercellular communication, GJIC)功能障碍是DR血-视网膜屏障损伤的重要机制。间隙连接蛋白蛋白43(Connexin43,Cx43)是构成细胞间隙连接的重要成分。研究表明,高糖可抑制视网膜内皮细胞和色素上皮细胞Cx43表达,导致GJIC功能障碍。我室前期研究表明,外源性ADMA可直接抑制内皮细胞Cx43mRNA表达,损伤GJIC功能。基于此,我们推测糖尿病时,ADMA可能通过干预视网膜周细胞Cx43表达,影响GIJC功能,进而促进视网膜微血管屏障损伤。Eph受体是新发现的酪氨酸蛋白激酶受体家族的分支。研究报导,EphA2受体参与细胞透性调节。在培养的人脑微血管内皮细胞,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)可通过上调EphA2信号通路增加细胞透性。另外,研究发现,VEGF是DDAH的下游靶点,提示糖尿病时,DDAH/ADMA亦可能通过调节EphA2信号通路,影响视网膜微血管屏障功能。本实验将在Ⅰ型糖尿病大鼠模型(不同时期)上观察ADMA在视网膜组织中的动态变化,确定ADMA与DR早期血-视网膜屏障损伤的内在联系；在原代培养的大鼠视网膜周细胞(Retinal pericytes, RPCs)中进一步确证DDAH/ADMA在高糖所诱导的血-视网膜屏障损伤中的作用,采用siRNA方法观察内、外源性ADMA是否能模拟高糖所诱导的血-视网膜屏障损伤,并进一步探讨DDAH/ADMA对血-视网膜屏障损伤的影响是否涉及ADMA/Cx43/GJIC途径和/或ADMA/EphA2途径。方法单次腹腔注射(60mg/kg) STZ建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型。实验随机分为正常对照组(二周、四周和八周)与糖尿病大鼠病程组(二周、四周和八周)。检测各组大鼠体重、血糖、胰岛素水平的变化,伊文思蓝法检测大鼠血-视网膜屏障功能,透射电镜观察血-视网膜屏障结构的完整性；取大鼠全血,分离血浆,检测大鼠ADMA (HPLC法)水平与NO水平(Griess法)；取大鼠房水,检钡ADMA水平(HPLC法)；荧光实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测视网膜组织Cx43和EphA2mRNA和蛋白表达。分离、培养和鉴定RPCs。实验分为三部分：①葡萄糖(30mM)处理RPCs1、3、5、7天；②外源性ADMA (3、10、30μM)、一氧化氮合酶抑制物单甲基精氨酸L-NMMA (30μM)和NO供体硝普钠(0.1mM)处理RPCs48h;③内源性ADMA处理RPCs48h(分为DDAH1siRNA, DDAH2siRNA, DDAH1+2siRNA)。Transwell小室检测RPCs透性；Hoechst法与Caspase-3活性检钡RPCs凋亡；划痕(SDLT)法检测IRPCs GJIC功能；HPLC法检测上清液ADMA水平；细胞免疫荧光法检测Cx43与p-Cx43蛋白表达；荧光实时定量PCR检测RPCs DDAH、Cx43与EphA2mRNA表达；蛋白质印迹法检测细胞DDAH、Cx43与p-Cx43蛋白表达。结果I型糖尿病大鼠血糖稳定持续升高,出现明显“三多”(多饮,多食和多尿)症状,且二周、四周和八周糖尿病大鼠的体重、血浆中胰岛素水平均较正常对照组显著降低,表明建模成功。血-视网膜屏障功能检测显示,与正常对照组大鼠相比,糖尿病大鼠组视网膜组织通透性均显著增加,并在八周达到高峰；同时大鼠视网膜外周血管相继出现水肿,细胞间间隙连接不完整,基底膜增厚,RPCs数目减少和屏障结构不完整。此外,同对照组大鼠相比,糖尿病大鼠房水与血浆中ADMA水平显著升高,视网膜组织Cx43mRNA与蛋白表达显著下调,EphA2mRNA表达显著上调。在原代培养的RPCs:①高糖可时间依赖性的增加RPCs透性,诱导RPCs凋亡,第5天达到显著差异,第7天更明显；高糖可显著增加细胞上清液ADMA水平,降低Cx43表达,抑制GJIC功能,并上调EphA2表达；②外源性ADMA可时间与剂量依赖性的增加RPCs透性,诱导RPCs凋亡,降低Cx43mRNA与蛋白表达并上调EphA2mRNA的表达,L-NMMA也产生类似的作用,NO供体(硝普钠)可部分逆转ADMA对RPCs的影响；③采用DDAH siRNA内源性增加ADMA水平,实验结果与外源性ADMA一致,可增加RPCs透性和凋亡,并且DDAH siRNA可加强高糖对RPCs的影响。结论1、ADMA与DR早期血-视网膜屏障损伤有关。2、DDAH/ADMA介导了高糖所诱导的RPCs血-视网膜屏障损伤,其机制涉及ADMA/Cx43/GJIC途径和ADMA/EphA2途径。