研究背景与目的支气管肺癌是目前世界上因恶性肿瘤而死亡的主要肿瘤之一,在过去的20年中,我国大中城市肺癌的发病率亦呈逐渐上升的趋势,其中非小细胞肺癌约占80%-85%。而肺腺癌在一些发达国家已成为最常见的肺癌类型,在我国其发生率也逐年上升,并已经超过肺鳞癌成为最常见的非小细胞肺癌,肿瘤可发生在各级支气管,但以小支气管为多,因此以周围型肿块多见。因临床症状就诊的非小细胞肺癌患者中,在确诊时约20%-30%为Ⅰ期和Ⅱ期,40%-50%为Ⅲ期,30%为Ⅳ期。目前以手术为主的综合治疗仍然是非小细胞肺癌的治疗模式。而早期或可手术治疗的局部晚期非小细胞肺癌在手术治疗后仍然有较高的复发率和远处转移率。不可手术切除和术后复发的非小细胞肺癌患者有一大部分患者需要接受化学药物治疗或针对驱动基因的靶向治疗。因此,化疗是非小细胞肺癌治疗的重要基石,其中,顺铂是我国最常用的铂类化疗药物之一,在治疗过程中容易出现化疗耐药或复发导致治疗失败。化疗耐药的出现是目前治疗失败的主要模式之一,使得肺癌总体疗效差,生存期短。随着药物化学和分子生物学研究的进一步深入,一些已知化疗药物耐药的分子机理基本阐明,主要包括药物靶点表达的改变与增强、药物进入靶细胞受阻、药物代谢排泄增加与失活、细胞DNA损伤及错配修复增强、靶细胞凋亡减少、药物代谢改变以及药物诱导的细胞核型改变等相关。有研究表明miRNA在肿瘤药物的代谢中起着重要的调节作用,因此可以通过研究调节miRNA的表达从而干预化疗耐药的机制的发生,包括miRNA多态性、参与调控耐药基因的表达等。miR-203(微小RNA-203)是一类非编码的长链小RNA,属于miRNA表达谱中的一员,被认为是一种调节因子,用以调节基因表达,通过靶mRNA分子的3’非编码区,促使靶mRNA的降解产生基因调控作用或在翻译水平上特异性抑制基因表达。miRNA-203对构建皮肤保护层、参与胚胎期表皮分化的调控中起着调节作用,并且与上皮组织肿瘤、牛皮癣、银屑病等皮肤性疾病的病理、生理过程中发挥着重要的作用。miRNA-203作为抑癌或致癌因子,其在与靶基因共同作用,来参与肿瘤细胞生成、增殖分化、侵袭转移,以及凋亡等。有文献报道miRNA-203在头颈部鳞状细胞癌、呼吸系统肿瘤如非小细胞肺癌、消化系统肿瘤如胃癌、肝癌、结直肠癌、泌尿系肿瘤如前列腺癌、血液系统肿瘤如慢性髓系白血病和B细胞白血病的肿瘤细胞生成等肿瘤中存在表达和功能调节。同时亦有研究发现调节miR-203在不同肿瘤组织中的表达,从而改变肿瘤细胞的代谢与功能,有望成为精准医学时代下恶性肿瘤的一种新的预测标记物,也可能成为一个潜在的治疗靶点,用以指导肿瘤的个体化、精准化治疗策略。目前有研究者通过108例采用顺铂化疗的膀胱癌患的肿瘤组织及体外膀胱癌细胞检测miR-203表达水平,结果发现,在膀胱癌进展期患者的miR-203表达水平明显低于未进展的患者,并且可以预测和区分肿瘤是否进展。miR-203低表达的患者的预后更差,表现在PFS及OS缩短,并可作为独立的预后预测因子。在体外膀胱癌细胞研究中,高表达miR-203的细胞对顺铂更敏感,增加了顺铂的药物杀伤作用,并促进细胞坏死和凋亡。同时也有研究者对miR-203在结直肠癌采用奥沙利铂化疗耐药的研究显示,高表达的miR-203可以减少奥沙利铂的药物毒性,增加产生化疗耐药,从而达到保护结直肠癌细胞,而通过抗miR-203的表达可以逆转这一现象,从而降低奥沙利铂化疗耐药的产生。这一研究显示了在不同的肿瘤及组织中,miR-203起着不同的作用和功能。ZEB2又叫ZFHXIB、SIP-1等,是由染色体2q22上的基因ZFHXIB所编码,由8个内含子和9个外显子组成,CDS区为3572碱基对,属于锌指结构转录因子中的E盒结合锌指蛋白(zinc finger E-box-binding protein,ZEB)家族的成员。ZEB2包含2个锌指簇(zinc-finger cluster)以及连接这两个锌指簇的可变序列,其中,N端和C端中的每一个锌指结构都能够独立结合目的基因的受调节区域中的5’-CACCT(G)碱基序列。目前的研究揭示了ZEB2在胚胎发育早期中的表达和功能,而最初关于ZEB2的报道是在非洲爪蟾的胚胎中发现了ZEB2的mRNA。ZEB2属于一种转录因子,起初的研究认为ZEB2定位于细胞核内,但是随着研究的深入开展,发现ZEB2不仅在细胞核内,其在细胞的胞浆以及其胞核中都有表达,它参与了细胞的炎症反应以及细胞的形成、生长、分化、凋亡、胚胎发育等多种生命活动调控。目前的研究认为ZEB家族在肿瘤的发生和发展中起着参与调控的作用。在非小细胞肺癌的研究显示,ZEB2的表达量与肿瘤T分期、肿瘤直径、临床分期正相关,与患者的术后生存期负性相关；在胃癌研究中,ZEB2被证实其在肠型胃癌中有着较高的表达,并且与其组织学的类型相关；在乳腺癌中,ZEB2高表达预示着总生存期较短,预后不良；在卵巢肿瘤的研究显示,ZEB2在癌性渗出液的表达高于原发灶；ZEB2的表达量在不同级别的神经胶质瘤中均较高,进一步分析显示,ZEB2的表达量与肿瘤的侵袭转移呈正相关。在胰腺癌中,ZEB2的高表达,促进病情进展；在结直肠肿瘤中,,ZEB2在癌旁组织与肿瘤组织的中心区域相比,癌旁组织呈高水平表达,可促进结直肠癌患者的病情进展,有可能作为结直肠肿瘤诊断的有效生物标记物或者作为结直肠癌的治疗新靶点：在恶性黑色素瘤中,ZEB2呈低水平表达,而且低表达的ZEB2可以促进黑色素瘤的进展,促进细胞发生恶性转化和克隆形成。在肝细胞性肝癌中,与癌中组组织的边缘组织相比,ZEB2的表达量降低,癌旁细胞的胞浆内ZEB2的高表达预示着手术治疗后患者生存期相对较长；而由此可见,ZEB2在不同肿瘤组织中、不同表达水平的ZEB2具有不同的调控作用。迄今为止,对于miR-203和ZEB2调节肺癌细胞化疗耐药的作用和机制尚未进一步阐明,我们设计并开展了本研究,探讨miR-203与ZEB2与肺腺癌细胞顺铂耐药的关系及其可能的机制,寻找肺腺癌治疗的新靶点,指导非小细胞肺癌的精准治疗和个体化治疗。研究目的1.研究过表达miR-203对A549和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性的影响2. 用miR-203 inhibitor抑制miR-203后,稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性的影响3.过表达/抑制miR-203对ZEB2和EMT标志物的影响4.MiR-203对ZEB2的调控机制5.ZEB2干扰后的A549及SPCA-1细胞对顺铂药敏感性影响6.ZEB2干扰后对miR-203表达的影响7.ZEB2对miR-203的调控机制研究内容与方法1稳定过表达miR-203肺腺癌细胞株的构建1)用miR-203慢病毒感染A549和SPCA-1细胞,构建稳定过表达miR-203的肺腺癌细胞株2)提取稳定过表达miR-203的肺腺癌细胞的总RNA3)使用Clontech试剂盒将RNA逆转录为cDNA4)运用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒检测感染miR-203慢病毒后肺腺癌细胞株A549及SPCA-1中miR-203的表达水平,以鉴定稳定过表达miR-203的细胞株是否构建成功2用MTT方法检测过表达miR-203对A549和SPCA-1细胞顺铂化疗敏感性的影响3 miR-203inhibitor对稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞顺铂化疗敏感性的影响1)将miR-203inhibitor瞬转入已经稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞中：2)提取瞬转miR-203 inhibitor前后细胞中的总RNA；3)使用Clontech试剂盒将RNA逆转录为cDNA;4)运用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR,检测]miR-203 inhibitor对miR-203表达的抑制效率；5)用MTT方法检测瞬转miR-203后,稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性；4过表达miR-203对ZEB2和EMT相关蛋白的影响1)提取稳定过表达miR-203前后的A549和SPCA-1细胞的蛋白并测浓度;2) Western blot检测过表达miR-203前后A549和SPCA-1细胞中ZBE2、E-cadherin、N-cadherin的表达水平；5. miR-203 inhibitor对稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞中ZEB2表达的影响1)将miR-203 inhibitor瞬转入稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞中：2)提取瞬转miR-203 inhibitor前后细胞中的蛋白并测浓度;3) Western blot检测瞬转miR-203 inhibitor后,稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞中ZEB2的变化；6.MiR-203靶基因检测验证1)用TargetScan和RNAhybrid在线数据库预测miR-203可能的靶基因,综合分析后ZEB2作为本研究中预测的靶基因：2)以psicheck-2质粒为载体,构建含有miR-203集合位点的双荧光素酶报告基因野生型载体psicheck-2/ZEB2 3’UTR与结合位点突变的双荧光素酶报告基因突变载体psicheck-2/ZEB2 mt 3’UTR;3)将野生型载体、突变型载体和psicheck-2质粒分别与miR-203mimics和inhibitor共同瞬时转染293T细胞,48h后检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性,根据海肾荧光素酶/萤火虫荧光素酶的比值确定miR-203是否直接靶向作用于ZEB2。7 ZEB2干扰后的A549及SPCA-1细胞对顺铂药物敏感性的影响1)将特异靶向ZEB2的三个siRNA片段及其对照片段瞬转入A549和SPCA-1细胞中；2)提取瞬转后细胞的总RNA和蛋白；3)用TaKaRa去DNA逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA;4)运用实时荧光定量PCR检测三个siRNA片段对ZEB2 mRNA水平的干扰效率；5)用Western blot检测实时荧光定量PCR鉴定干扰效果最好片段对ZEB2蛋白水平的干扰效果;6)用MTT方法检测干扰ZEB2后,肺腺癌细胞A549和SPCA-1对顺铂的化疗敏感性；8.ZEB2对miR-203表达的影响1)将特异靶向ZEB2的：siRNA片段及其对照片段瞬转入A549和SPCA-1细胞中,干扰ZEB2的表达；2)提取瞬转后细胞的总RNA；3)使用Clontech试剂盒将RNA逆转录为cDNA;4)运用实时荧光定量PCR检测干扰ZEB2后肺腺癌细胞A549和SPCA-1中miR-203的表达；9.ZEB2对miR-203的调控机制1)用JASPAR和ALGGEN数据库分析预测ZEB2与miR-203启动子区域的结合情况；2)染色质免疫共沉淀(ChIP)实验验证ZEB2与miR-203启动子区域的结合情况；10统计学分析采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。结果用x±s表示。荧光定量PCR结果的比较采用两独立样本t检验,MTT检测细胞药物剂量反应采用析因设计资料的方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1稳定过表达miR-203肺腺癌细胞株的构建用miR-203慢病毒颗粒感染肺腺癌A549细胞和SPCA-1细胞,使其过表达miR-203,并通过荧光定量Q-PCR方法鉴定其过表达效率。结果显示,在肺腺癌A549细胞和SPCA-1细胞中,与阴性对照组相比,转染miR-203慢病毒的细胞中miR-203的表达水平明显升高(P<0.05),说明过表达miR-203的肺腺癌细胞株构建成功,可用于后续实验。2过表达miR-203对A549和SPCA-1细胞顺铂化疗敏感性的影响用MTT方法检测过表达miR-203后A549和SPCA-1细胞对顺铂化疗的药物剂量反应,绘制出药物剂量反应曲线,统计分析显示,在A549和SPCA-1细胞株中,过表达miR-203后,细胞对顺铂更敏感,IC50值均降低,且两个不同处理组之间存在显著性差异(P<0.001)。说明过表达miR-203可增加肺腺癌细胞对顺铂化疗的敏感性,降低肺腺癌细胞对顺铂的耐药。3 miR-203 inhibitor可逆转稳定过表达miR-203后A549和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性1)为了进一步研究miR-203对肺腺癌细胞对药物化疗的影响,我们在稳定过表达miR-203的肺腺癌细胞中,再次转染miR-203 inhibitor,并通过荧光定量Q-PCR检测miR-203在肺腺癌A549细胞和SPCA-1细胞中的表达,与稳定过表达miR-203组细胞相比,miR-203 inhibitor使这些细胞中miR-203的表达水平明显降低了(P<0.05),说明miR-203 inhibitor能够抑制miR-203的表达。2)为了从另一个方向研究miR-203对肺腺癌细胞对药物化疗的影响,我们在稳定过表达miR-203的A549细胞中,用miR-203 inhibitor抑制了miR-203的表达,并通过MTT方法检测A549细胞对顺铂的敏感性,绘制出A549对顺铂的药物剂量反应曲线,发现转入miR-203 inhibitor后,稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞对DDP的敏感性降低了,IC50值增加了,说明miR-203 inhibitor逆转了稳定过表达miR-203后A549和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性,下调miR-203的表达能够增加肺腺癌细胞对顺铂耐药。4 miR-203对ZEB2和EMT相关蛋白的影响研究已经表明,ZEB2是调控细胞上皮间质转化的一个重要因子,且EMT相关蛋白在肿瘤的耐药中亦起着重要的作用,为了寻找miR-203调控肺腺癌细胞化疗敏感性的机制,过表达miR-203后,通过Western Blot法检测肺腺癌细胞中ZEB2和EMT相关蛋白的变化。结果显示,在肺腺癌A549和SPCA-1细胞株中,高表达miR-203可以抑制转录因子ZEB2和间质标志物N-cadherin的表达,促进上皮标志物E-cadherin表达。反之,当在稳定过表达miR-203的细胞中导入miR-203 inhibitor后,ZEB2的表达则升高了。说明miR-203能够介导ZEB2调控EMT相关蛋白。5.miR-203靶向作用于ZEB2的3’UTR1)我们用TargetScan在线软件预测miR-203的靶基因,发现ZEB2可作为候选靶基因,随后用UCSC Genome Bioinformatic获得候选靶基因ZEB2的3’UTR序列,从miRBase数据库找到成熟hsa-miR-203的序列,然后用RNAhybrid软件预测出miR-203于ZEB2 3’UTR的结合位点。2)我们成功构建了psicheck-2/ZEB2 wt 3’UTR质粒和psicheck-2/ZEB2 mut3’UTR质粒,分别与miR-203 mimics和inhibitor共转染293T细胞,转染48h后检测荧光素酶活性。结果显示,psicheck-2/ZEB2 wt 3’UTR质粒和miR-203mimics一起转染时,可明显降低荧光素酶的活性,差异具有统计学意义(P<0.001),而与miR-203 inhibitor共转染可显著增强荧光素酶活性(P<0.001)。突变质粒psicheck-2/ZEB2 mut 3’UTR分别与miR-203 mimics和inhibitor共转染后,与psicheck-2载体组相比,荧光素酶活性没有明显变化(P>0.05)。这些结果表明,miR-203能够与ZEB2的3’UTR端特异性结合。6干扰ZEB2对A549及SPCA-1细胞顺铂药物敏感性的影响1)为了进一步观察ZEB2对肺腺癌细胞对顺铂化疗药物敏感性的影响,我们用三个能特异性靶向ZEB2的siRNA干扰A549及SPCA-1细胞中的ZEB2表达,用实时荧光定量PCR鉴定其干扰效率,选取干扰效果最好的2号siRNA,并用Western blot鉴定证实该siRNA能够使ZEB2的蛋白表达下调,说明该siRNA可运用进行后续实验。2)用siRNA干扰A549和SPCA-1细胞中的ZEB2后,通过MTT方法检测A549和SPCA-1细胞对顺铂的敏感性,绘制出A549和SPCA-1对顺铂的药物剂量反应曲线。统计分析显示,干扰ZEB2后A549及SPCA-1细胞对DDP的敏感性增加了,IC50值降低了(P<0.05),说明干扰ZEB2可增加肺腺癌细胞对顺铂的敏感性。7干扰ZEB2使肺腺癌细胞中miR-203的表达升高在A549和SPCA-1细胞中,用靶向沉默ZEB2的siRNA干扰ZEB2后,我们用实时荧光定量PCR检测miR-203的表达变化,结果显示,与未干扰ZEB2组相比,肺腺癌细胞A549和SPCA-1中miR-203的表达水平均增加了。说明在miR-203靶向调控ZEB2时,ZEB2也可以反馈调节miR-203的表达。8 ZEB2与miR-203的启动子区域结合从而调控miR-203的表达1)我们先在NCBI数据库中找到miR-203的启动子区域,再用JASPAR和ALGGEN数据库预测可能调控miR-203的转录因子,发现ZEB2在miR-203的启动子区域有两个相对保守的结合位点。2)我们用染色质免疫共沉淀(ChIP)分别验证ZEB2与miR-203启动子区域两个结合位点的结合情况,发现与阴性对照抗体IgG相比,ZEB2与miR-203启动子区域的结合更多：而用siRNA干扰ZEB2后,发现ZEB2与miR-203启动子区域的结合减少了。这些结果表明ZEB2通过结合于miR-203的启动子区域从而调控miR-203的表达。结论1、过表达miR-203增加肺腺癌A549细胞和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性。2、miR-203 inhibitor可逆转miR-203引起的肺腺癌细胞对顺铂的化疗敏感。3、过表达miR-203抑制ZEB2和EMT相关蛋白N-cadherin的表达,促进E-cadherin的表达。4、miR-203 inhibitor可逆转过表达miR-203引起的ZEB2上调。5、miR-203直接靶向作用于ZEB2的3’UTR抑制ZEB2的表达。6、干扰ZEB2后使肺腺癌细胞对顺铂的化疗敏感性增加.7、干扰ZEB2使肺腺癌细胞中miR-203的表达升高.8、ZEB2与miR-203的启动子区域结合,均可作为肺腺癌治疗的新的靶点,用以指导非小细胞肺癌的精准治疗和个体化治疗。