【摘 要】
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干扰素是在特定的诱生剂作用下由淋巴细胞分泌的具有抗病毒、影响细胞生长分化、抗肿瘤和调节免疫功能等活性的糖蛋白。在动物体内自身存在的干扰素极其微量,以传统的方法难以
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干扰素是在特定的诱生剂作用下由淋巴细胞分泌的具有抗病毒、影响细胞生长分化、抗肿瘤和调节免疫功能等活性的糖蛋白。在动物体内自身存在的干扰素极其微量,以传统的方法难以制备和纯化,因此利用基因工程技术生产重组干扰素是解决这一难题的有效途径。
根据Genebank上报道的水貂IFN-α和IFN-β序列设计引物,以新鲜水貂肝脏提取的总基因组为模板经PCR扩增出IFN-α基因约564bp和和IFN-β基因约561bp两个片段,按常规方法克隆到pMD-18T载体,经蓝白斑筛选和酶切分析获得阳性重组质粒,并进一步对两片段进行序列分析。分别设计了一对扩增IFN-α基因和IFN-β基因成熟肽的引物,在引物的上下游分别带有EcoRⅠ、Xho(l)Ⅰ酶切位点,以pMD-IFN-α和pMD-IFN-β为模板,通过PCR扩增获得目的片段并且进行回收,用相同的限制性内切酶酶切表达载体pET32a后构建重组表达载体pET32a-IFN-α和pET32a-IFN-β,并转入E.coliDH5α中,得到基因工程菌,经酶切和测序鉴定证明克隆到载体pET32a上的外源基因即为水貂IFN-α和IFN-β成熟肽基因。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE与Westernblot鉴定,可产生相对分子量约为36KDa和34KDa的表达产物,表明成功地建立了IFN-α和IFN-β蛋白的重组表达系统。
对表达的蛋白运用尿素洗涤的方法进行纯化,并通过细胞病变抑制法测定干扰素的抗病毒活性,结果显示IFN-α和IFN-β均在MDCK细胞上对VSV具有一定的的抗病毒活性。
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